金紅春 蘭時(shí)樂 胡毅 毛小偉 肖調(diào)義

隨著水產(chǎn)飼料業(yè)的高速發(fā)展，魚粉資源的不斷枯竭，加上近年來國(guó)內(nèi)外陸生養(yǎng)殖動(dòng)物流行病害嚴(yán)重，動(dòng)物蛋白源如肉骨粉、禽肉粉、血漿制品等的使用受到嚴(yán)重限制[1-4]。棉粕是我國(guó)除豆粕之外常用的替代魚粉的植物蛋白源，因此棉粕的開發(fā)利用是解決我國(guó)蛋白質(zhì)資源短缺的主要途徑之一。作者在前人研究基礎(chǔ)上采用由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)及酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等組成的復(fù)合菌固體發(fā)酵棉粕，生產(chǎn)棉粕蛋白飼料，通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定其最佳發(fā)酵工藝，試圖找到一種不僅能避免化學(xué)添加劑和物理法對(duì)棉籽蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響，還會(huì)改善適口性，提高蛋白質(zhì)含量，既安全又可降低成本，具有很好發(fā)展?jié)摿Φ囊环N有效方法，為棉粕發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 發(fā)酵菌種

發(fā)酵菌種由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院實(shí)驗(yàn)室提供，粉末狀固體，活菌數(shù)＞1010CFU/g。

1.1.2 發(fā)酵原材料

棉粕、麥麩由湖南湘北水產(chǎn)飼料有限公司提供，棉粕粗蛋白41.25%、淀粉酶活力580 U/g、脂肪酶活力260 U/g；麥麩粗蛋白16.46%,淀粉酶活力180 U/g、脂肪酶活力150 U/g。。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、瓊脂1.5%～2.0%，pH值7.0～7.2，121℃滅菌25 min。

液體種子培養(yǎng)基[6]：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、葡萄糖5%、pH值7.0～7.2，121℃滅菌25 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：棉粕、麥麩分別占發(fā)酵底物的80%、20%，葡萄糖2%，（NH4）2SO41%，固水比1∶0.5，pH值7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

菌種活化：將保存于冰箱的斜面種子接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)36 h。

液體種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)36 h的斜面種子分別接種于液體種子培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18～24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按5%的接種量（V/W）接種于裝量為50 g/250 ml三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻后，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)過程中從培養(yǎng)開始每24 h搖動(dòng)1次。

1.2.2 單因素條件研究

培養(yǎng)方法與1.2.1節(jié)相同，替換不同的條件，即棉粕與麥麩的比例、葡萄糖含量、（NH4）2SO4添加量、發(fā)酵溫度、初始pH值、含水量、接種量、發(fā)酵時(shí)間、裝量等，測(cè)定不同條件下各營(yíng)養(yǎng)成分的變化情況。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.3 測(cè)定及分析方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

全自動(dòng)凱氏定氮儀（FOSS），kjeltecTM 2300。

1.3.2 淀粉酶活力的測(cè)定

采用顧賽紅[7]報(bào)道方法，即3、5-二硝基水楊酸法測(cè)定。酶活定義為:在40℃條件下，每分鐘催化可溶性淀粉水解生成1 μmol麥芽糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/g）。

1.3.3 脂肪酶活力的測(cè)定

采用張海燕[8]報(bào)道方法，即銅皂法測(cè)定。酶活定義為：在37℃條件下，每分鐘催化脂肪水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的脂肪酶量定義為一個(gè)脂肪酶國(guó)際單位(U/g)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理分析

試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，Duncan氏多重比較檢驗(yàn)均值的差異顯著性,當(dāng)P＞0.05時(shí),表示差異不顯著，當(dāng)P＜0.05時(shí),表示差異顯著，結(jié)果用平均值(M)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示，用Excel 2000進(jìn)行圖表分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

2.1.1 棉粕與麥麩比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

改變發(fā)酵培養(yǎng)基棉粕與麥麩的比例（100∶0；95∶5；90∶10；85∶15；80∶20；75∶25），30℃恒溫培養(yǎng)5 d，發(fā)酵料低溫烘干后，測(cè)定粗蛋白含量及淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶酶活（見圖1）。

圖1 棉粕與麥麩比例對(duì)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

從圖1可知，粗蛋白含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力隨培養(yǎng)基中麥麩比例增加而升高，當(dāng)棉粕與麥麩的比例為90∶10時(shí)，達(dá)到最高，粗蛋白含量達(dá)到39.41%；淀粉酶活力746 U/g，與其他比例條件下相比達(dá)到最高；脂肪酶活力比發(fā)酵前的249提高了132 U/g，達(dá)到381 U/g。隨后增加培養(yǎng)基中麥麩的比例，粗蛋白含量隨之降低，兩種酶活明顯降低，因此，選擇棉粕與麥麩的比例為90∶10。

2.1.2 葡萄糖含量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

按質(zhì)量比在培養(yǎng)基中分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的葡萄糖，以不加葡萄糖為對(duì)照組，其它條件不變，見圖2。

圖2 葡萄糖含量對(duì)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

從圖2可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入葡萄糖對(duì)粗蛋白含量的影響較大。培養(yǎng)基中隨著葡萄糖含量增加，粗蛋白含量下降較快，對(duì)提高營(yíng)養(yǎng)成分含量不利。葡萄糖含量對(duì)淀粉酶活力影響較小，但淀粉酶活力、脂肪酶活力都隨添加量的增加而降低。因此，發(fā)酵過程中不需要在培養(yǎng)基中加入葡萄糖作為微生物生長(zhǎng)的速效碳源。

2.1.3 硫酸銨含量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

分別在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量比的硫酸銨(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)，以不加硫酸銨為對(duì)照，見圖3。

圖3 硫酸銨含量對(duì)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

從圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵培養(yǎng)基中隨著(NH4）2SO4含量的增加，營(yíng)養(yǎng)成分含量也隨之增加。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中(NH4）2SO4含量為1%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白與不添加硫酸銨對(duì)照組的39.97%相比提高了0.58%，達(dá)到40.55%；淀粉酶活力比對(duì)照組748 U/g提高了103 U/g，達(dá)到861 U/g；脂肪酶與對(duì)照組相比提高了82 U/g,達(dá)到最高474 U/g。當(dāng)(NH4）2SO4含量超過1%，營(yíng)養(yǎng)成分呈下降趨勢(shì)。(NH4）2SO4作為微生物生長(zhǎng)的速效氮源，在發(fā)酵前期，對(duì)微生物的生長(zhǎng)有利，但發(fā)酵培養(yǎng)基中(NH4）2SO4的含量過高，改變了培養(yǎng)基的碳氮比，導(dǎo)致微生物大量生長(zhǎng)而不分泌或少分泌某些酶類，從而影響了各成分含量。

2.2 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.2.1 溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于30、35、40、45℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

溫度是微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的重要影響因素之一，合適的發(fā)酵溫度，有利于微生物的生長(zhǎng)和代謝。從圖4可知，在30～40℃范圍內(nèi)，粗蛋白含量，淀粉酶、脂肪酶活力隨溫度的升高而提高。當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃時(shí)，達(dá)到最高，但隨著發(fā)酵溫度的進(jìn)一步升高，各成分隨之下降，可能是因?yàn)楦邷匾种屏宋⑸锂a(chǎn)生酶所致。

2.2.2 pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對(duì)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

從圖5可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.0時(shí)，粗蛋白含量為42.10%、淀粉酶活力1 037 U/g、脂肪酶活力548 U/g，較其他pH值條件下達(dá)到最高水平。當(dāng)pH值為8.5時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中的各營(yíng)養(yǎng)成分最低。初始pH值大于6.0，發(fā)酵培養(yǎng)基中的各成分隨之下降，其原因有待進(jìn)一步研究。

2.2.3 含水量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為30%、35%、40%、45%、50%、55%，40℃恒溫發(fā)酵5 d，結(jié)果見圖6。

從圖6可以看出，隨著發(fā)酵料中含水量的增加，粗蛋白含量也在增加，淀粉酶、脂肪酶酶活也隨之提高，當(dāng)含水量為50%時(shí)，粗蛋白含量達(dá)到40.99%，淀粉酶酶活887 U/g，比未發(fā)酵前540 U/g提高了347 U/g；脂肪酶活力比發(fā)酵前提高了233 U/g。但含水量超過50%，各成分下降明顯。主要原因?yàn)榘l(fā)酵料中過高的含水量，可降低發(fā)酵料中氧氣濃度，從而導(dǎo)致厭氧發(fā)酵，影響營(yíng)養(yǎng)成分含量提高。

圖6 含水量對(duì)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.2.4 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

按菌種接種量分別為（V/W）2%、3%、4%、5%、6%、7%接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，結(jié)果見圖7。

圖7 接種量對(duì)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

接種量的大小可直接影響發(fā)酵進(jìn)度和代謝產(chǎn)物的生成量。接種量太小，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間及增加雜菌污染的機(jī)會(huì)；接種量太大，可導(dǎo)致發(fā)酵前期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，不利于產(chǎn)物的形成和毒性物質(zhì)的降解。圖7結(jié)果表明，當(dāng)接種量為6%時(shí)，發(fā)酵料中粗蛋白含量達(dá)到42.63%；淀粉酶活力1 158 U/g，比其他接種量條件下活力提高明顯，與發(fā)酵前相比提高了618 U/g；脂肪酶活力比發(fā)酵前提高289 U/g，達(dá)到了538 U/g。但增加接種量，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量下降。

2.2.5 裝量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

250 ml三角瓶中分別裝入30、40、50、60、70、80、90 g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果見圖8。

圖8 裝量對(duì)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

圖8表明，當(dāng)250 ml三角瓶中裝入70 g發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，粗蛋白含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力與其他裝量條件下相比，達(dá)到最高值，分別為42.94%、1 314 U/g、546 U/g。

2.2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響

在得到的上述最優(yōu)條件下，分別發(fā)酵3、4、5、6、7 d，結(jié)果見圖9。

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

從圖9可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵料中營(yíng)養(yǎng)成分的含量和酶活也隨之提高，到發(fā)酵第6 d，粗蛋白含量43.76%；淀粉酶活力1 306 U/g,提高了766 U/g；脂肪酶活力548 U/g，提高了299 U/g。發(fā)酵4 d，脂肪酶活力提高最低，比發(fā)酵前只提高了251 U/g。發(fā)酵3～5 d，淀粉酶活力、粗蛋白含量變化不明顯。但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量反而降低，主要原因是微生物代謝消耗所致。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用（NH4）2SO4添加量、物料含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間作為考察的4個(gè)因素，分別選取3個(gè)水平，以粗蛋白含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力為考察指標(biāo)，結(jié)果見表1。

根據(jù)表1結(jié)果可知，處理4的粗蛋白含量顯著高于其他8組處理及未發(fā)酵對(duì)照組(P＜0.05)，其他8組處理的粗蛋白含量也都極顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。9組處理的淀粉酶活力均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，處理組1、2、3、5、6、7、8、9之間淀粉酶活力不存在顯著性差異（P＞0.05），處理4最高為1 306 U/g，顯著高于其他組處理（P＜0.05）。纖維素酶活力9組處理都顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，處理1、2、3、7、8組間無顯著差異（P＞0.05），處理5、6組間也不存在顯著差異（P＞0.05），處理4活力較高，顯著高于其他組（P＜0.05）。9組處理脂肪酶活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，處理4脂肪酶活性最高達(dá)548 U/g，顯著高于其他處理組（P＜0.05），處理組1、2、3和5之間不存在顯著差異（P＞0.05），處理組6、7和8之間也不存在顯著差異（P＞0.05）。由粗蛋白含量、淀粉酶活力和脂肪酶活力及極差分析可得出：A2B1C2D3為最佳設(shè)計(jì)方案，即（NH4）2SO4添加量1%，含水量50%，發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時(shí)間6 d。棉粕發(fā)酵后CP提高6.99個(gè)百分點(diǎn)、淀粉酶活力提高766 U/g、脂肪酶活力提高299 U/g，均顯著高于未發(fā)酵對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 微生物固態(tài)發(fā)酵棉粕后蛋白質(zhì)含量變化

五株芽孢桿菌和酵母菌發(fā)生協(xié)同作用，使得微生物大量繁殖，向細(xì)胞外分泌一定量的多肽、酶蛋白等物質(zhì)，同時(shí)利用底物及非蛋白氮合成大量菌體蛋白[9]。由試驗(yàn)結(jié)果可知，發(fā)酵產(chǎn)物中，粗蛋白提高了6.99個(gè)百分點(diǎn)，比張慶華等報(bào)道提高的2.29%又提高了4.70個(gè)百分點(diǎn)，主要原因是微生物生長(zhǎng)繁殖過程中消耗底物而導(dǎo)致發(fā)酵物的絕對(duì)含量減少和微生物利用非蛋白氮合成菌體蛋白，從而提高了發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量[10]。

3.2 微生物固態(tài)發(fā)酵棉粕后酶活性變化

芽孢桿菌株在其生長(zhǎng)繁殖過程中能夠產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶和少量脂肪酶等酶類[11-12]。酵母菌能產(chǎn)生氨基酸、維生素(K、B、泛酸、煙酸、生物素、肌醇和葉酸等)[13-15]。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的各種消化酶、氨基酸、維生素等也大大提高了棉粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在最佳發(fā)酵條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中淀粉酶活力較發(fā)酵前的540 U/g提高了766 U/g，脂肪酶較發(fā)酵前的249 U/g提高了299 U/g。

3.3 微生物固態(tài)發(fā)酵棉粕的最佳條件

以粗蛋白含量、總游離氨基酸含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力和纖維素酶活力作為固態(tài)發(fā)酵效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)復(fù)合芽孢桿菌和酵母菌共同固態(tài)發(fā)酵棉粕的組成及其配比，添加碳源、氮源種類及濃度，培養(yǎng)基的含水量進(jìn)行了優(yōu)化，得到固態(tài)發(fā)酵最佳條件為：棉粕∶麥麩為90∶10，（NH4）2SO4添加量1%，發(fā)酵溫度40℃，物料含水量50%，接種量6%，裝量為70 g/250 ml三角瓶，發(fā)酵時(shí)間6 d。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)及結(jié)果

本試驗(yàn)按照得到的最優(yōu)水平又進(jìn)行了堆積發(fā)酵底物1 t驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果接近，說明優(yōu)化結(jié)果是可信的，具有較強(qiáng)的生產(chǎn)指導(dǎo)意義,為棉粕在畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中利用多菌種、多重發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)生物飼料提供了一條新途徑。

[1] 王紅梅,葉明強(qiáng),鄺哲師,等.微生物發(fā)酵處理棉籽餅柏的研究進(jìn)展[J].中國(guó)飼料,2007,18:7-10.

[2] 俞曉輝,姚文,施學(xué)仕,等.大豆發(fā)酵蛋白替代魚粉對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腸道主要菌群的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2008，20(1)：46-51.

[3] 劉珍,張貴云,張麗萍.發(fā)酵棉柏替代豆柏飼喂蛋雞試驗(yàn)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006,34(1):79-80.

[4] Francis G,Makkar H P S,Becker K.Antinutritional factors present in plant-derived altemate fish feed ingredients and their effects in fish[J].Aquaculture,2001,199(3-4):197-227.

[5] 周連玉，朱莉莉，鄧旭武，等.黃蘑菇深層發(fā)酵條件研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，36（1）：110-112.

[6] 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986.

[7] 顧賽紅，孫建義，李衛(wèi)芬.黑曲霉PES固體發(fā)酵對(duì)棉籽粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2003,18(1):70-73.

[8] 張海燕,丁玉,尹瑞卿,等.脂肪酶酶活性的最新研究[J].生物學(xué)通報(bào),2007,3(42):16-17.

[9] 張文舉，許梓榮，孫建義，等.假絲酵母ZD-3與黑曲霉ZD-8復(fù)合固體發(fā)酵對(duì)棉籽餅脫毒及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2006,21(6):129-135.

[10] 張慶華，趙新海，鐘麗鵑，等.三株菌協(xié)同固態(tài)發(fā)酵對(duì)棉粕脫毒效果及其生物活性的影響[J].飼料工業(yè)，2007,28（18）：37-38.

[11] 余冰,傅婭梅,葉楠,等.固態(tài)發(fā)酵對(duì)復(fù)合蛋白質(zhì)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值改善效果的研究[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2009，21(4)：546-553.

[12] Castillo,R.,Gallardo,M.R.,Maciel,M.,et al.Effects of feeding rations with genetically modified whole cottonseed to lactating Holstein cows[J].Journal of Dairy Science,2004,87:1778-1785.

[13] 李美群，熊興耀，譚興和，等.溫度對(duì)紅薯酒糟沼氣發(fā)酵的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，36（2）：233-236.

[14] Kumar R S,Singhal K K.Chemical composition and nutritional evaluation of transgenic cottonseed for ruminants[J].Indian Journal of Animal Sciences,2004,74(5):868-871.

[15] Moreira V R,Satter L D,Harding B.Comparison of conventional linted cottonseed and mechanically delinted cottonseed in diets for dairy cows[J].Journal of Dairy Science,2004,87:131-138.