鮑宏云 閆素梅 喬良 倪麗麗 高民 成海榮

維生素A是奶牛重要的微量營(yíng)養(yǎng)素之一，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促進(jìn)胚胎發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體免疫，維持正常視覺及上皮細(xì)胞完整性所不可缺少的低分子有機(jī)化合物(Gudas等,1994)[1]，因此，在日糧中添加適宜劑量的維生素A充分滿足維生素A的需要對(duì)奶牛是非常重要的。瘤胃在反芻動(dòng)物消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過程中起著重要的作用，其發(fā)酵是保證反芻動(dòng)物正常生命活動(dòng)的重要因素。一些研究發(fā)現(xiàn)反芻動(dòng)物日糧中的維生素A只有一部分進(jìn)入小腸（Fernandez，1976)[2]，另一部分維生素A在經(jīng)過瘤胃時(shí)被降解（Rode等，1990）[3]。Weiss等（1995）[4]的研究指出維生素A的降解與日糧精粗比有關(guān)，且高精料日糧條件下維生素A在瘤胃內(nèi)有較高的降解率。喬良亦指出（2007）[5]維生素A的降解率與精粗比及添加劑量有關(guān)。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中人們通常采用提高維生素A添加量、飼喂過瘤胃保護(hù)維生素A或肌肉注射維生素A等方法來(lái)滿足反芻動(dòng)物機(jī)體維生素A的需求。但是這些方法均會(huì)影響反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)維生素A的含量。而關(guān)于瘤胃內(nèi)維生素A含量的改變是否會(huì)對(duì)瘤胃發(fā)酵造成一定影響的報(bào)道卻相當(dāng)有限。鑒此，本試驗(yàn)擬利用體外批次培養(yǎng)法，研究不同日糧精粗比、不同來(lái)源及添加水平的維生素A對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響，進(jìn)而為實(shí)際生產(chǎn)中合理選用維生素A的補(bǔ)加方法提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選擇3頭健康、體重相近、安裝有永久瘤胃瘺管，并且處于干奶期的荷斯坦奶牛作為瘤胃液的供體牛。供體牛每日早7點(diǎn)和晚7點(diǎn)兩次飼喂，飼喂結(jié)束后擠奶自由飲水。

1.2 試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)日糧參照中國(guó)奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2004）配制，其組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.3 維生素A源

VA 由羅氏(上海)維生素有限公司生產(chǎn),以維生素A醋酸酯微粒形式存在，效價(jià)：50萬(wàn)IU/g。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用2×3完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，第一因素為培養(yǎng)底物的精粗比，設(shè)2∶8和5∶5兩個(gè)水平，第二因素為維生素A的添加劑量，設(shè)低、中、高3個(gè)水平，分別為每毫升培養(yǎng)液中5.8、11.7、23.3 IU。試驗(yàn)共分6個(gè)處理組，每處理組于體外培養(yǎng)開始后的4、8、12、24 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(DM基礎(chǔ))

1.5 體外培養(yǎng)裝置

體外批次培養(yǎng)裝置自行設(shè)計(jì)，用150 ml培養(yǎng)瓶，瓶口安裝橡皮塞，主體為恒溫水浴搖床，水浴溫度和振蕩頻率可調(diào)。

1.6 瘤胃液的采集

于晨飼前采集瘤胃液，迅速將樣品倒入已預(yù)熱達(dá)39℃并通有CO2的保溫瓶中，并且使3頭奶牛的瘤胃液等量混合，經(jīng)兩層紗布過濾后，加入到預(yù)先裝有緩沖液和培養(yǎng)底物的培養(yǎng)瓶中備用。

1.7 體外培養(yǎng)液的制備

體外批次培養(yǎng)的培養(yǎng)體系為60 ml，其中瘤胃液與緩沖液的比例為1∶2，緩沖液的配制及體外培養(yǎng)操作過程參照盧媛（2002）[6]的方法進(jìn)行。體外培養(yǎng)過程中所用培養(yǎng)底物分為高精料與低精料兩組，兩組的精粗比分別為5∶5和2∶8。培養(yǎng)底物添加量為0.5 g。體外培養(yǎng)底物組成見表2。

表2 體外培養(yǎng)底物組成（DM基礎(chǔ)）

1.8 測(cè)定指標(biāo)與方法

pH值用pHS-3B型精密pH計(jì)測(cè)定；揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，測(cè)定程序參照秦為琳(1982)[7]的方法進(jìn)行。體外培養(yǎng)液氨氮(NH3-H)濃度的測(cè)定參照馮宗慈等（1993）[8]的比色方法進(jìn)行測(cè)定。菌體蛋白（BCP）用John（1997）[9]的方法進(jìn)行處理，采用Bradford（1976）[10]的方法測(cè)定菌體蛋白含量。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL2003進(jìn)行初步整理，利用SAS軟件中的方差分析（ANOVA）進(jìn)行差異性顯著檢驗(yàn)和多重比較。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 日糧精粗比、維生素A添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液pH值的影響（見表3）

由表3結(jié)果可知，高精料組體外培養(yǎng)液中的pH值在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于低精料組（P＜0.05）。維生素A添加水平（5.8～23.3 IU/ml）對(duì)pH值的影響差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 日糧精粗比、維生素A添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液pH值的影響

2.2 日糧精粗比、維生素A添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液VFA含量的影響（見表4～表8）

由表4、表5、表6、表7、表8的結(jié)果可知，高精料組在體外培養(yǎng)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的乙酸、丙酸、丁酸及TVFA含量均顯著高于低精料組（P＜0.05）。維生素A的添加劑量在5.8～23.3 IU/ml范圍內(nèi)對(duì)乙酸、丙酸、丁酸及TVFA含量的影響較小。高精料組在24 h時(shí)的乙丙比顯著低于低精料組（P＜0.05）,說(shuō)明高精料組產(chǎn)生的丙酸在TVFA中所占比例較高。維生素A的添加劑量在5.8～23.3 IU/ml范圍內(nèi)，對(duì)乙丙比的影響也較小。在體外培養(yǎng)的過程中，除4 h外，不同維生素A添加劑量之間對(duì)于乙丙比的影響均不顯著(P＞0.05)。

表4 日糧精粗比及VA添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液乙酸含量的影響（mmol/l）

表5 日糧精粗比及VA添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液丙酸含量的影響（mmol/l）

2.3 日糧精粗比、維生素A添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液氨氮（NH3-N）濃度的影響（見表9）

由表9可見，高精料組在體外培養(yǎng)的4、12、24 h氨氮濃度均顯著高于低精料組（P＜0.05）。維生素A添加劑量（5.8～23.3 IU/ml）對(duì)體外培養(yǎng)液氨氮濃度的影響在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均不顯著(P＞0.05)。從整體趨勢(shì)看，各處理組的氨氮濃度均隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。

2.4 日糧精粗比、維生素A添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液菌體蛋白（BCP）含量的影響（見表10）

由表10的結(jié)果可知，高精料組在體外培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液BCP含量均顯著高于低精料組(P＜0.05)。維生素A添加劑量（5.8～23.3 IU/ml）對(duì)體外培養(yǎng)液BCP含量的影響在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均不顯著(P＞0.05)。

表6 日糧精粗比及VA添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液丁酸含量的影響（mmol/l）

表7 日糧精粗比及VA添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液乙丙比的影響

表8 日糧精粗比及VA添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液TVFA含量的影響（mmol/l）

表9 日糧精粗比及VA添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液NH3-N濃度的影響（mg/100 ml）

表10 日糧精粗比及VA添加水平對(duì)體外培養(yǎng)液BCP含量的影響（mg/100 ml）

3 討論

3.1 維生素A添加水平對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

關(guān)于維生素A添加水平對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響研究報(bào)道極少，研究結(jié)果也不盡一致。李飛等(2000)[11]報(bào)道，在肉牛日糧中添加適量的維生素A（5 000 IU），與對(duì)照組相比可以提高瘤胃中乙酸濃度和玉米秸稈干物質(zhì)的有效降解率(P＜0.05)。同時(shí)，匡偉等（2006）[12]的報(bào)道指出在體外瘤胃培養(yǎng)液中添加一定劑量的維生素A能夠使培養(yǎng)液pH值呈上升趨勢(shì)，NH3-N和VFA的平均濃度呈下降趨勢(shì)，但差異不顯著(P＞0.05)。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，維生素A的添加劑量（5.8～23.3 IU/ml）對(duì)于體外培養(yǎng)液pH值、VFA含量、氨氮濃度與BCP濃度的影響均較小。這些結(jié)果說(shuō)明在5.8～23.3 IU/ml范圍內(nèi)，維生素A的添加水平對(duì)瘤胃微生物的生長(zhǎng)與繁殖無(wú)明顯影響。關(guān)于造成研究結(jié)果不一致的原因尚不清楚，可能與動(dòng)物種類、添加劑量等因素有關(guān)，還需要進(jìn)一步探討。

3.2 日糧精粗比對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

pH值是反映瘤胃發(fā)酵水平的一項(xiàng)綜合指標(biāo)。它直接受唾液分泌、氨氮、VFA及其它有機(jī)酸生成、吸收和排出等諸多因素的影響，而引起瘤胃pH值波動(dòng)的根本原因則是日糧結(jié)構(gòu)和日糧營(yíng)養(yǎng)[13，14]。在體外培養(yǎng)試驗(yàn)中，不存在唾液的分泌及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外排的情況，因此影響培養(yǎng)液中pH值的變化的主要因素是VFA和有機(jī)酸的產(chǎn)生和吸收以及氨氮濃度的變化，VFA含量升高、氨氮濃度下降時(shí)pH值則下降。在本試驗(yàn)中，高精料組在所有時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液的pH值均顯著低于低精料組(P＜0.05)。究其原因是由于低精料組培養(yǎng)底物中有較高纖維含量。纖維物質(zhì)中所含的糖類多為結(jié)構(gòu)性碳水化合物，其在瘤胃中發(fā)酵速度緩慢，從而使微生物產(chǎn)生VFA和其它有機(jī)酸的速度減緩，進(jìn)而導(dǎo)致相同時(shí)間點(diǎn)，低精料組pH值高于高精料組。

反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵所產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸約占進(jìn)入機(jī)體代謝的碳流量的2/3（Sauvant等，1995）[15]，是反芻動(dòng)物賴以生存、保持正常生長(zhǎng)、泌乳、繁殖的主要能源，可提供反芻動(dòng)物總能量需要量的70%～80%(Bergman等1975;王加啟，1992）[16，17]因此，VFA濃度也是瘤胃發(fā)酵的主要指標(biāo)之一；瘤胃發(fā)酵類型即乙酸/丙酸比也明顯地影響著能量的利用率和能量?jī)?chǔ)存部位。乙酸是反芻動(dòng)物乳脂合成的主要前體，丙酸則是反芻動(dòng)物重要的葡萄糖前體，因此丙酸型發(fā)酵能為機(jī)體提供更多的能量。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)VFA的吸收總是遵循丁酸吸收最快，丙酸次之，乙酸最慢的規(guī)律[18]。影響瘤胃VFA含量和比例的最關(guān)鍵因素是日糧結(jié)構(gòu)，Merchen等(1986)[19]用高粗料和高精料羯羊日糧做對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明瘤胃內(nèi)總VFA濃度不受影響，但高精料日糧組乙酸和丁酸的濃度顯著降低，丙酸濃度顯著升高。Hart(1987)[20]卻認(rèn)為，隨著肉牛日糧中高粱籽實(shí)添加量的增加，乙酸和丁酸的濃度不受影響，丙酸的濃度卻顯著升高。在本試驗(yàn)的研究結(jié)果中，高精料組在體外培養(yǎng)的各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)TVFA、乙酸、丙酸、丁酸含量均高于低精料組，且兩組各種酸的含量均隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。體外培養(yǎng)24 h時(shí)，高精料組乙丙比均顯著低于低精料組(P＜0.05)。這說(shuō)明雖然高精料組能夠刺激微生物產(chǎn)生更多的揮發(fā)性脂肪酸，但是低精料組發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸在總揮發(fā)性脂肪酸中所占比例較高，而丙酸比例較低。

瘤胃中的NH3-N主要來(lái)源于食糜中蛋白氮和非蛋白氮的降解，瘤胃NH3-N濃度在一定程度上反應(yīng)了特定日糧組成下，飼料蛋白降解速率與微生物蛋白合成速率間所達(dá)到的平衡狀況(McDonald,1988)[21]。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，高精料組氨氮的濃度在體外培養(yǎng)的4、12、24 h均顯著高于低精料組(P＜0.05)，同時(shí)高精料組在上述時(shí)間點(diǎn)的BCP含量也高于低精料組，這說(shuō)明高精料組對(duì)于飼料蛋白質(zhì)的降解能力優(yōu)于低精料組。

菌體蛋白的含量直接反映瘤胃中細(xì)菌的數(shù)量。由本試驗(yàn)的結(jié)果可知，高精料組BCP的含量在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于低精料組。說(shuō)明高精料能夠促進(jìn)瘤胃細(xì)菌的增加。

4 小結(jié)

①日糧精粗比顯著影響各項(xiàng)奶牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)；提高日糧中的精料比例可以促進(jìn)揮發(fā)性脂肪酸的生成，促進(jìn)氨氮的釋放與BCP的合成，降低pH值。②維生素A添加水平在5.8～23.3 IU/ml范圍內(nèi)，對(duì)奶牛瘤胃體外發(fā)酵的影響較小。

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