葉成玉，王戈平，陸 艷，蔡其剛，牛小迎，李曉卉，馬利青

（青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 810016）

馬巴貝斯原蟲病是馬屬動物包括（馬、驢、騾和斑馬）的一種蜱媒病，這種疾病是由馬屬小巴貝斯原蟲[babesia（theileria）equi]和馬巴貝斯原蟲（babesia caballi）血源性寄生原蟲引起的。其死亡率取決于受侵害動物的總體免疫狀況及病原生物的毒力。高死亡率常發(fā)生在從無巴貝斯原蟲的區(qū)域引進到巴貝斯原蟲流行地區(qū)的最初感染的馬匹中。

在流行地區(qū)，嚴重的巴貝斯原蟲病的臨床病例病情相對罕見，馬屬動物巴貝斯原蟲病在歐洲、非洲、阿拉伯、亞洲（日本除外）的許多地區(qū)流行。由于潛在的蜱媒介幾乎全球分布，必須防止攜帶者引入到非流行地區(qū)或國家[1]。在進口到非流行地區(qū)或國家之前，通過對馬屬動物巴貝斯原蟲病血清學試驗必須證明是陰性的[1-3]。目前，補體結合試驗（CFT）的和間接熒光抗體試驗（IFAT）通常用于檢測B.equi和B.caballi寄生蟲抗體的存在。

然而，這些血清學試驗受到抗原供應有限和特異性差的限制[1-2]。最近，我們開發(fā)了采用重組抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA試劑盒），并表明該ELISA試劑盒可以分別替代CFT和IFAT作為B.equi和B.caballi感染的診斷方法[4-9，11-13]。在本研究中，我們用重組抗原的ELISA診斷試劑盒對中國新疆西部驢的馬屬動物巴貝斯原蟲病的流行進行了調查。

青海省位于中國西北部，是中國最大的內陸省。氣候是具有溫暖的夏天和寒冷的冬天主要是氣候干燥的大陸，平均氣溫夏季（7月）為25.7℃（喀什）或22.7℃（伊犁）及冬季（1月）-6.0℃（喀什）或-9.5℃（伊犁）。馬屬動物是這青海地區(qū)重要的動物，并被當?shù)厝嗣駨V泛用于交通運輸，至今青海的馬屬動物還沒有關于馬巴貝斯原蟲病流行的報道，而臨近的新疆地區(qū)的馬屬動物有馬巴貝斯原蟲病流行的報道[15]。

1 材料和方法

1.1 重組抗原

1.1.1 一種用以大腸桿菌表達重組截短的巴貝斯蟲裂殖子抗原2（EMA2t）并通過pGEX傳播媒介的ELISA法，對于驢上B.equi感染的診斷，如前所述進行[7]。

1.1.2 一種采用以大腸桿菌表達重組的Bc48蛋白并以pGEX為傳播媒介的ELISA方法，用于對驢上B.caballi感染的診斷，采用別處描述的方法進行[8-9]。

1.1.3 陰、陽性標準血清，均為日本國家原蟲中心玄學南博士惠贈，青海省畜牧獸醫(yī)科學院獸醫(yī)所生物技術研究室保存。

1.2 被檢血清的采集和處理

1.2.1 317份馬屬動物血清血清樣品均采自青海省，其中：馬血清192份（分別采自烏蘭縣76份；德令哈市18份；湟源縣98份）；騾血清46份（互助縣19份；民和縣27份）；驢血清79份（湟中縣）。

1.2.2 采血時均空腹、橈靜脈采集，采集后擺成斜面，置 4℃冰箱5 h后，放在室溫待血清析出后收集血清，-20℃冷凍保存待檢。

1.3 其他試劑和耗材

均購自國內和 Sigma公司供應商。

1.4 ELISA方法

1.4.1 抗原的包被 重組的B.equi GST-EMA2t蛋白、B.caballi GST-Bc48和GST作為抗原，按10μg/mL劑量加到包被液中（50mm carbonate-bicarbonate buffer，pH9.6），混勻后加到 96 孔平底微量板（Nunc，Denmark）的孔里，每孔50μL，并且在4℃條件下培養(yǎng)過夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween 20的PBS沖洗液沖洗一次后，殘留的粘附物的部位用含3%脫脂乳的封阻液進行封阻，每孔100μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.3 加樣 隨后微量板用沖洗液沖洗一次，在封阻液中按1:100滴度稀釋被檢血清后，每個樣品平行加到微量板的兩個孔中，每孔50μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.4 加二抗 用沖洗液沖洗6次后，在封阻液中按1:4000滴度稀釋辣根過氧化物酶結合了山羊抗馬、騾和驢的 IgG 抗體（Bethyl Laboratories，USA），稀釋后每孔加50μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.5 底物 用沖洗液沖洗6次后，每孔加100μL底物，每mL底物中含有0.3 mg的 1，2’-azino-bis（3-ethylbenz-thia zoline-6-sulfonic acid），0.1M 檸檬酸，0.2M的磷酸緩沖液和0.003%H2O2，每孔加100μ L。

1.4.6 讀數(shù) 用Wellscan MK 3酶標讀數(shù)儀（Labsystems Dragon，F(xiàn)inland）在光吸收值OD415nm條件下測定光吸收值。

1.4.7 判定標準 ELISA滴度表示成最大稀釋度的倒數(shù)，且展示ELISA值是等于或大于0.2，在B.equi GST-EMA2t蛋白、B.caballi GST-Bc48和GST孔之間的光密度吸收值是不同的，兩個孔之間的差值為該被檢樣品的光密度吸收值（OD值）。兩孔陽性血清對照孔的平均值必須大于0.3；兩孔陰性血清對照孔的平均值必須低于0.2；兩孔待檢樣品的平均值等于或大于0.2為陽性，低于0.2為陰性。

2 結果

經過對所收集的317份馬屬動物血清抗體的檢測，共檢出B.equi血清16份，陽性率為5.05%；B.caballi血清11份，陽性率為3.47%；其中烏蘭縣的76份馬血清中檢出B.equi血清3份，陽性率為3.95%；B.caballi血清2份，陽性率為2.63%；德令哈市的18份馬血清中檢出B.equi血清2份，陽性率為11.11%；B.caballi血清1份，陽性率為5.56%；湟源縣的18份馬血清中檢出B.equi血清2份，陽性率為2.04%；B.caballi血清2份，陽性率為2.04%；互助縣的19份騾血清中檢出B.equi血清2份，陽性率為10.05%；B.caballi血清0份，陽性率為0%；民和縣的27份騾血清中檢出B.equi血清3份，陽性率為11.11%；B.caballi血清2份，陽性率為7.41%；湟中縣的79份驢血清中檢出B.equi血清4份，陽性率為5.06%；B.caballi血清2份，陽性率為5.06%。同時有4分血清既是B.equi陽性和又是B.caballi陽性，其中2份來自烏蘭縣的馬血清，2份來自湟中縣的驢血清。結果初步說明我省馬屬動物群中存在B.equi和B.caballi的感染，詳見表1。

3 討論

中國以前僅有少量的關于馬equinebabesiosis流行的報道[12-14]。近年來，關于馬equine babesiosis的報道增多。因此，引起了分別在中國西北部和東北部的新疆和吉林省的高度關注。據(jù)我們的了解，這是在中國驢匹上關于馬屬動物巴貝斯蟲病調查描述的首次報道。在與中國新疆邊境接壤的蒙古有幾篇關于馬屬動物巴貝斯蟲病流行的報道已發(fā)表[11，15-16]。這些研究表明在蒙古和Battsetseg等地的馬B.equi和B.caballi感染廣泛傳播[17]。據(jù)報道在蒙古Dermacentor nuttalli能夠傳播這兩種巴貝斯蟲。在流行地區(qū)控制可能的蜱媒被認為減少感染和增加馬和驢的數(shù)量和質量的一種有效方法?，F(xiàn)今對于新疆地區(qū)馬屬動物巴貝斯焦蟲病的蜱媒介仍是未知的，因此，迫切需要鑒定新疆地區(qū)涉及B.equi和 B.caballi傳播的潛在媒介。

總之，在馬上B.equi比B.caballi感染更為普遍，然而，在本研究中，在新疆西部驢B.equi（9.6%）感染的陽性率低于B.caballi（38.7%）。此時該原因仍然未知，需要做大規(guī)模流行病學研究來闡述這個問題。

在本研究中，所有被檢測的317份馬屬動物血清均采自本地區(qū)，表明equine babesiosis在該地區(qū)馬屬動物血清上呈地方流行性，需要設計更正式的流行病學研究以確定感染的群體動力學和可能的傳播媒介的角色。另外，所有血清學陽性的馬屬動物血清均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，自從這些馬屬動物血清不斷的接觸B.equi和 B.caballi感染，它們可能獲得了相對較高的免疫性。

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