朱詠梅，朱來華，鄭小龍，王宮璞，王 琰

（1.青島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266000；2.山東出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266002）

FMD是由FMDV引起的偶蹄類動物烈性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入必須通報的動物疫病。該病傳播快、宿主范圍廣、發(fā)病率高，對畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成極大威脅。近年來我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，口蹄疫是重大的潛在威脅。與發(fā)達國家通常采取的撲殺政策不同，發(fā)展中國家普遍采用免疫的方法來控制該病。因此，如何快速、可靠地區(qū)分免疫動物和感染動物，對于FMD的防制以及國際貿(mào)易尤為重要。

基于動物感染FMDV后，既能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體，又能產(chǎn)生NSP抗體，而疫苗免疫動物主要誘導(dǎo)機體產(chǎn)生FMDV結(jié)構(gòu)蛋白抗體，與結(jié)構(gòu)蛋白相比，非結(jié)構(gòu)蛋白的變異較少，相對保守[1]。在FMD診斷中，區(qū)分免疫動物和自然感染動物是一項十分重要的內(nèi)容，鑒別自然感染動物和免疫動物也是OIE判定一個國家有無FMD流行的依據(jù)。近年來，陸續(xù)建立了檢測FMDV NSP抗體的診斷方法，以區(qū)分FMDV感染動物和注射疫苗動物。以下就FMD中NSP的研究進展綜述如下。

1 FMDV相關(guān)NSP的種類

FMDV的NSP是指除了衣殼蛋白1A、1B、1C、1D和它們的前體蛋白之外的所有由病毒編碼但不參與病毒衣殼組成的蛋白，包括成熟蛋白L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D以及它們的前體。NSP參與病毒的復(fù)制、多聚蛋白的裂解和病毒顆粒的組裝過程。其中L和3C能抑制宿主細胞的蛋白合成，在病毒蛋白的成熟裂解過程中作為蛋白酶裂解聚蛋白，2A為P1/2A間裂解提供識別序列2BC、2C、3AB和3CD形成復(fù)制復(fù)合物，為病毒RNA的合成創(chuàng)造條件，與裝配有關(guān)[1]。

1966年Cowan等[2]發(fā)現(xiàn)一種病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗原（即3D）僅與感染動物血清反應(yīng)，由此建立的免疫擴散試驗與動物食道咽部病毒分離技術(shù)相結(jié)合，曾被認為是一種可靠的鑒別診斷方法。但后來發(fā)現(xiàn)，反復(fù)接種滅活疫苗的動物體內(nèi)會不同程度地產(chǎn)生抗3D抗體，該方法受到質(zhì)疑。近年來，開始研究用其他非結(jié)構(gòu)蛋白取代3D來區(qū)分注苗動物和感染動物。Berger等[3]研究發(fā)現(xiàn)，血清中存在NSP抗體可以作為感染FMD康復(fù)動物的標(biāo)志，若血清中同時存在至少2種NSP抗體（3D抗體除外）就可以斷定該動物感染過FMDV，但如血清中不存在一種或所有的NSP抗體，并不能肯定該動物從來就沒有感染過FMDV。

Rodriguez等[4]對感染FMDV的豬和疫苗接種豬體內(nèi)的NSP免疫原性及特異性進行了研究，發(fā)現(xiàn)3ABC抗體是由活FMDV在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的，因此3ABC最適合用于鑒別FMDV感染豬和疫苗接種豬，并指出抗3ABC抗體在感染后2周即可檢測到。Lubroth等[5]發(fā)現(xiàn)，血清中2C和3ABC抗體的存在可作為區(qū)分FMD恢復(fù)動物（帶毒者）和疫苗接種動物。Mackey等[6]指出，2C、3A、3ABC 抗體的存在也可以作為鑒別感染和疫苗接種動物的指標(biāo)，并且對于牛和豬血清，3ABC是最為可靠的、可單獨使用的指標(biāo)?？?ABC抗體在感染后早期就出現(xiàn)，并且在血清中維持可被檢測水平的時間比任何其他的NSP都長[7]。

20世紀(jì)90年代以來，各國研究者通過對2C、3A、3ABC等FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白的深入研究，發(fā)現(xiàn)針對F3ABC、3B的血清抗體水平可以作為區(qū)分免疫動物和感染動物的指標(biāo)。在現(xiàn)代疫苗加工過程中，2C、3A、3B和3C等非結(jié)構(gòu)蛋白會被去除，因此免疫動物體內(nèi)不會產(chǎn)生針對NSP的抗體，只會誘導(dǎo)產(chǎn)生針對病毒衣殼蛋白的抗體。而當(dāng)動物感染FMDV并出現(xiàn)病毒復(fù)制后，無論表現(xiàn)為臨床或亞臨床癥狀，動物都會出現(xiàn)2種抗體，一種是針對衣殼蛋白的抗體，一種是針對NSP的抗體，后者可以用來區(qū)分免疫動物和感染動物[8]。

2 通過測定NSP抗體區(qū)分感染動物和注射疫苗動物的研究進展

建立檢測NSP抗體試驗的目的之一是試圖區(qū)分感染動物和注射疫苗動物。OIE的動物衛(wèi)生法典規(guī)定要求：宣布無FMD的國家應(yīng)進行血清學(xué)監(jiān)測，以證明本國確實無FMDV感染。FMDV結(jié)構(gòu)蛋白抗體的存在是曾接觸過FMDV的證據(jù)（通過疫苗接種或感染），因此，在非疫苗接種的國家，檢測病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體已經(jīng)成為一種血清學(xué)監(jiān)測方法。在非接種疫苗或近期內(nèi)不用疫苗或已停止接種疫苗的國家將檢測NSP抗體作為間接評估病毒在畜群中活動的標(biāo)志。

在區(qū)分感染動物與注射疫苗動物之前，還必須先了解FMDV的NSP的體液免疫和細胞免疫兩類免疫應(yīng)答的特性。Bergerman[9]等報道了利用放射免疫沉淀法（RIP）對有限數(shù)量動物進行研究的結(jié)果，闡述了NSP在注射疫苗動物和感染動物體內(nèi)的免疫應(yīng)答。

2.1 體液免疫

在小核糖核酸病毒科中只有FMDV和心病毒有編碼前導(dǎo)蛋白L的基因。因此，檢測FMDV感染動物L(fēng)抗體應(yīng)當(dāng)是高度特異的。遺憾的是，L蛋白的免疫原性比其他的NSP低。不是所有感染過的動物都產(chǎn)生L抗體，即使產(chǎn)生應(yīng)答，持續(xù)時間也很短暫。L抗體應(yīng)答并結(jié)合其他NSP應(yīng)答的檢測是FMDV感染的證據(jù)。感染動物產(chǎn)生2B抗體，并證明它含有B細胞表位的肽，但至今尚未建立能用于檢測2B抗體的重復(fù)性好的ELISA。Meyer[10]等報道了用桿狀病毒表達的2C作為抗原的ELISA。Mezencio[11]等檢測了各種來源的注射疫苗動物和感染動物血清中的2C抗體，發(fā)現(xiàn)注射疫苗動物的2C抗體很少有陽性，而FMDV感染動物2C抗體則全部是陽性。Mezencio[11]等亦證明，牛和豬2C抗體的衰退比3ABC抗體衰退要快，并且注射疫苗的牛體偶爾也能檢測到2C抗體。

已發(fā)表的資料表明，檢測3ABC多肽抗體是確定感染的標(biāo)記之一，許多研究者都認同這一觀點。在組成3ABC多聚蛋白的3種蛋白中，3A的免疫原性最好，3C誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)較弱，但它包含在3ABC多肽中能提高3ABC抗原作為感染標(biāo)志的可靠性。有些研究報告還進一步證實了3ABC抗原作為感染標(biāo)記的可靠性。Mackey等[6]比較了3ABCELISA和EITB鑒別感染動物的效果，認為3ABCELISA是鑒別感染動物的有效方法，3ABCELISA陽性血清或可疑血清可用EITB進一步確證。Brochi[12]等利用3ABCELISA檢查1996年在巴爾干地區(qū)流行的FMDVA型血清，有臨床癥狀的動物都檢出了3ABC抗體，而注射過疫苗的動物，不管疫苗的來源、佐劑類型、接種次數(shù)，3ABC抗體都是陰性。

3D蛋白是NSP中免疫原性最好的一個，雖然只測定3D抗體不能區(qū)分感染動物和注射疫苗動物，但它仍可作為早先接觸過非特異FMDV抗原的指標(biāo)。在3ABC陽性動物血清中檢出3D抗體為證明早先感染進一步提供了證據(jù)，反之，檢測到FMDV結(jié)構(gòu)蛋白和3D抗體，則是早先注射過疫苗的標(biāo)志。

2.2 細胞免疫

FMDV感染可誘導(dǎo)細胞免疫，但產(chǎn)生免疫應(yīng)答的細胞成分尚不清楚，有報道通過體外增殖和感染動物體內(nèi)延遲過敏反應(yīng)（DTH），能夠證明T2細胞對FMDV NSP，特別是2B、2C和3D的免疫應(yīng)答。DTH反應(yīng)有可能用于區(qū)分感染動物和注射疫苗動物的研究正在進行之中。

3 NSP抗體診斷應(yīng)用及發(fā)展前景

1991年，Neitart[13]等建立了酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)印試驗（EITB）技術(shù)，可以同時檢查血清中幾種NSP抗體。不久，Bergerman[9]證實，檢測FMDVNSP抗體水平可以用于區(qū)分感染和免疫動物。Bergmann等比較了分別以3A、3B、2C、3D和3ABC作為診斷抗原，應(yīng)用間接ELISA試驗檢測感染牛的敏感性和準(zhǔn)確性，結(jié)果以3A、3B和3ABC為抗原檢出的結(jié)果與病毒分離和EITB的檢出結(jié)果一致，尤其是3ABC的效果最好。在單個NSP中，研究者一致認為多聚蛋白3ABC抗體是檢測FMD預(yù)先感染的最可靠單一指示器，并推薦檢測3ABC抗體的試驗。

Berger等[3]研究發(fā)現(xiàn)，血清中存在NSP抗體可以作為感染FMD康復(fù)動物的標(biāo)志，若血清中同時存在至少2種NSP抗體（3D抗體除外）就可以斷定該動物感染過FMDV，但如血清中不存在一種或所有的NSP抗體，并不能肯定該動物從來就沒有感染過FMDV。Rodriguez等[4]對感染FMDV的豬和疫苗接種豬體內(nèi)的NSP免疫原性及特異性進行了研究，發(fā)現(xiàn)3ABC抗體是由活FMDV在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的，口蹄疫疫苗免疫的動物很少有3ABC、3AB等NSP抗體，3ABC和3AB檢測方法常用于檢測動物是否感染口蹄疫病病毒。其中3ABC最適合用于鑒別FMDV感染豬和疫苗接種豬，抗3ABC抗體在感染后2周即可檢測到，并且在血清中維持可被檢測水平的時間比任何其他的NSP都長，適用于大批量的動物普查，用于找到隱性感染口蹄疫病毒的動物。

目前學(xué)者確認以生物工程技術(shù)制備的3ABC作為抗原的ELISA方法是區(qū)分FMDV自然感染和疫苗免疫動物的理想方法，疫苗生產(chǎn)工藝，在病毒純化過程中去除了絕大部分非結(jié)構(gòu)蛋白，因此滅活疫苗免疫動物體內(nèi)沒有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體產(chǎn)生，而自然感染動物體內(nèi)既有結(jié)構(gòu)蛋白抗體又有非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體，因此，檢測FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的ELISA方法不但可以檢測隱性感染動物，而且可以區(qū)分自然感染動物和滅活疫苗免疫動物。美國率先推出了FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA診斷試劑盒，在許多國家和地區(qū)進行區(qū)域性試驗，并在美國、阿根廷和中國臺灣省申請了專利。

在國際貿(mào)易中，實施FMD血清學(xué)檢驗的目的是鑒別動物是否有帶入FMDV的危險，由于已感染的牛能夠形成持續(xù)性感染，不管是否接種過疫苗，所有血清陽性的牛都認為有危險，并將其剔除。對于進出境檢疫樣品的血清學(xué)檢驗，要強調(diào)試驗絕對敏感，但對于流行病學(xué)監(jiān)測，強調(diào)試驗的特異性，若FMD疫苗含有殘留的微量NSP，也能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的抗體，特別是重復(fù)注射疫苗后尤為明顯，試驗要求能夠可靠地確定動物是否已感染了FMDV，不管它們是否注射過疫苗。在野外檢測重復(fù)注射疫苗動物血清時，偶爾也能檢測到NSP抗體陽性或可疑抗體。Bergerman等[9]還發(fā)現(xiàn)，年齡大的、重復(fù)注射疫苗的動物偶爾在EITB試驗中出現(xiàn)1條或1條以上NSP陽性反應(yīng)帶，對所有 5條帶（2C、3B、3ABC、3D）都發(fā)生反應(yīng)的非常罕見，只有1頭年齡最大的牛出現(xiàn)過這種情況。已發(fā)表的研究結(jié)果表明，檢測FMDVNSP（非3D）抗體不是早先感染的絕對證據(jù)，還須考慮血清陽性動物的年齡和感染史。在制定檢測病毒活動的血清學(xué)監(jiān)測計劃時，考慮動物的年齡和注射疫苗史同樣重要。Bergman建議，為了避免由于注射疫苗或在以前接觸過抗原產(chǎn)生陽性結(jié)果的問題，采樣的動物應(yīng)限制在2歲以下。

有學(xué)者研究了注射疫苗后再感染牛的NSP抗體應(yīng)答，以確定注射疫苗NSP轉(zhuǎn)陽后再接觸FMDV的動物是否得到保護。Brochi等[14]證明，大多數(shù)注射疫苗的牛，在攻毒后3ABC抗體轉(zhuǎn)陽，可是沒有檢查過這些牛的帶毒狀況。因此，尚不能把3ABC抗體與攻擊后是否形成感染聯(lián)系在一起。Sorensen等[15]和Mackay等[16]檢查采自注射過疫苗然后攻毒牛的血清，發(fā)現(xiàn)某些注射過疫苗又進行攻擊后形成持續(xù)性感染的牛NSP抗體不轉(zhuǎn)陽。另有證據(jù)表明，帶毒動物血清轉(zhuǎn)陽與形成持續(xù)感染的水平相關(guān)，而持續(xù)感染的水平又與接種疫苗的效力有關(guān)。不管動物是否接種過疫苗，3ABC抗體的檢測（通常與其它NSP中的1種或1種以上的抗體聯(lián)合）是確定是否感染FMDV的證據(jù)。以畜群整體而言，檢測3ABC抗體能夠監(jiān)測病毒在注射疫苗牛群中的活動情況。就單個動物而言，注射疫苗后呈陰性結(jié)果并不意味著該動物從來沒有接觸過FMDV。

因此在實際檢測過程中，如僅用3ABC-ELISA單一方法，不可避免就會出現(xiàn)假陽性問題。所以還需要一種更特異的快速診斷方法。EITB是有酶聯(lián)免疫和免疫印跡試驗相結(jié)合而開發(fā)的試驗，可同時檢測最常見的5種非結(jié)構(gòu)蛋白（3ABC，3D，2C，3B和3A）。而在滅活疫苗中，5種非結(jié)構(gòu)蛋白可能同時微量存在，或可能1～2種出現(xiàn)較多，同時大量出現(xiàn)這5種非結(jié)構(gòu)蛋白的可能性很低，因此判定結(jié)果時下列3種情況為陰性：（1）不出現(xiàn)5條印跡；（2）某一印跡不明顯，濃度低于陽性對照；（3）印跡明顯（等同或高于陽性）的條帶不超過2條。目前，3ABC-ELISA和EITB聯(lián)合檢測診斷系統(tǒng)已由泛美地區(qū)口蹄疫診斷中心（OIE口蹄疫參考實驗室）開發(fā)，廣泛應(yīng)用于泛美地區(qū)口蹄疫的診斷、監(jiān)控，并得到OIE認可[9]。首先，應(yīng)用3ABC-ELISA檢測非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體進行初篩，如3ABC-ELISA陽性或可疑，再用EITB檢測五種非結(jié)構(gòu)蛋白抗體（3ABC，3D，2C，3B和3A），如EITB仍為陽性，再用病毒分離鑒定方法進行確證。

目前，單獨用血清學(xué)方法不足以鑒別持續(xù)性感染（不管是否接種過疫苗），還必須應(yīng)用直接檢測病原的技術(shù)。病毒分離試驗雖然敏感，但獲得結(jié)果要花費幾日的時間。今后的研究是確定在野外和實驗條件下檢測病毒在注射疫苗畜群中的活動及采樣的方式等。如果PCR技術(shù)進一步自動化，在短時間內(nèi)能夠處理大量樣品，將對動物調(diào)運檢疫極有價值。用附加擴增步驟的巢式PCR或利用檢測PCR產(chǎn)物的ELISA技術(shù)能提高RT-PCR的敏感性。PCR在人醫(yī)和獸醫(yī)上的廣泛應(yīng)用促使該技術(shù)向快速、簡易方向發(fā)展。毫無疑問，PCR有可能成為鑒定FMDV帶毒者的可靠方法。

綜上所述，檢測NSP抗體試驗在FMD診斷中的應(yīng)用具有特別的意義。檢測FMDV結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白抗體仍然是鑒別動物是否接觸過FMDV抗原最敏感、特異的方法。而檢測FMDVNSP抗體方法已經(jīng)建立，并且極其有效。只用血清學(xué)辦法不能絕對地區(qū)分自然感染與注射疫苗動物，如果動物既接種過疫苗又被感染，則大多數(shù)動物的NSP抗體呈現(xiàn)陽性，在動物NSP抗體陽性血清中，多聚蛋白3ABC抗體的檢測是最可靠的指示器。檢測其他的NSP，如L、2B、2C、3A或3ABC中的1個或1個以上的抗體，可為確定動物是否感染FMDV提供了更確實的證據(jù)。以畜群或組為單位，檢測3ABC、2C和3AB抗體，能夠證明注射疫苗群是否早先感染。不能把結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性，但3ABC抗體陰性的單個動物簡單地認為是注射過疫苗的動物。這樣的動物還應(yīng)當(dāng)檢查是否存在病毒，然后才能確定。只檢測3D不能區(qū)分是感染動物還是注射疫苗動物，因為許多FMD疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生3D抗體，結(jié)構(gòu)蛋白和3D蛋白抗體陽性而其他NSP抗體陰性的動物，是早先接種疫苗的標(biāo)志。今后的研究方向是建立一種方法，將檢測NSP抗體的方法和檢測病毒的RT-PCR結(jié)合為一體，使其能快速、可靠地鑒別是否接種過疫苗的所有感染動物。

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