王月婷，王宗保

（南華大學(xué)藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖南衡陽(yáng) 421001）

1 小型豬簡(jiǎn)介

小型豬是珍稀豬種，原產(chǎn)地是中國(guó)和越南。我國(guó)的小型豬主要是在其原產(chǎn)地經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期近親交配而形成的封閉群，具有體型小，遺傳穩(wěn)定性等特點(diǎn)。國(guó)外小型豬的培育多采用世界各地小體型豬種或野豬進(jìn)行多品種雜交選育而成，雖然品種多，但缺乏資源優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)外用小型豬來(lái)制備糖尿病模型的有Yucatan小型豬、Yorkshire小型豬、G?ttingen小型豬、Sinclair小型豬等，國(guó)內(nèi)有廣西巴馬小型豬、貴州小型豬、五指山小型豬、版納微型豬等。

2 小型豬糖尿病模型的制備

2.1 單獨(dú)高糖高脂飼料喂養(yǎng)制備模型

基礎(chǔ)飼料的能量比如下：總能量為16.84 MJ/ kg，攝入能量為13.34 MJ/kg，其中蛋白質(zhì)含量約占15.98％，脂肪為4.71％，碳水化合物為62.19％。高糖高脂飼料是由10％的豬油、37％的蔗糖和53％的基礎(chǔ)飼料組成，能量比如下：總能量為18.46 MJ/kg，攝入能量為15.95 MJ/kg，蛋白質(zhì)占8.48％，脂肪12.50％，碳水化合物69.59％。飼料配方及所還有的能量沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，都大同小異。陳華等［1］以高糖高脂飼料同時(shí)喂養(yǎng)了4-5月齡的巴馬小型豬、五指山小型豬、中國(guó)農(nóng)大小型豬。結(jié)果巴馬小型豬和五指山小型豬對(duì)高糖高脂飼料誘導(dǎo)糖尿病比較敏感，實(shí)驗(yàn)5～6月后出現(xiàn)糖代謝異常，表現(xiàn)為體型肥胖、血清胰島素升高和胰島素敏感性下降。而中國(guó)農(nóng)大小型豬對(duì)高糖高脂飼料誘導(dǎo)糖尿病相對(duì)不敏感，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中血清葡萄糖水平、胰島素含量、胰島素敏感性指數(shù)和靜脈糖耐量實(shí)驗(yàn)（IVGTT）都無(wú)顯著變化，僅在實(shí)驗(yàn)后期表現(xiàn)為肥胖、胰島素敏感性指數(shù)下降。Xi等［2］和Liu等［3］分別用貴州小型豬和巴馬小型豬誘導(dǎo)糖尿病，他們?cè)诟咛歉咧暳现刑砑恿四懝檀?，其配方如下?1％的基礎(chǔ)飼料、10％的豬油、37％的蔗糖和2％的膽固醇。結(jié)果是貴州小型豬在喂養(yǎng)6個(gè)月后出現(xiàn)了顯著的糖尿病癥狀和血管病變。巴馬小型豬在5個(gè)月后出現(xiàn)了高糖血癥、高胰島素血癥和脂代謝紊亂，同時(shí)有尿糖和腎炎糖尿病腎病等癥狀。由此可見(jiàn)高糖高脂飼料添加膽固醇可加速糖尿病的形成，同時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也會(huì)出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化癥狀。

2.2 鏈脲佐菌素的應(yīng)用

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）對(duì)一定種屬動(dòng)物的胰島素細(xì)胞有選擇性破壞作用，對(duì)機(jī)體組織毒性相對(duì)較小，動(dòng)物存活率高，目前是國(guó)內(nèi)外使用較多的制備糖尿病動(dòng)物模型的藥物。純的STZ為白色粉末狀，在光照下易分解，因此需低溫避光保存。STZ購(gòu)買后應(yīng)保存在-20℃。現(xiàn)配現(xiàn)用，用時(shí)應(yīng)溶解在緩沖液中。溶解STZ的緩沖液有生理鹽水、檸檬酸緩沖液等，通過(guò)不同溶劑溶解STZ后血糖模型的比較，最后指出pH4.5檸檬酸緩沖液可以作為理想的溶劑［4］，因此推薦用檸檬酸緩沖液溶解STZ。新鮮配制的檸檬酸緩沖液溶解STZ溶液呈現(xiàn)透明的微黃色，如果顏色變深或者有氣泡產(chǎn)生，說(shuō)明該試劑的穩(wěn)定性受到破壞，將導(dǎo)致STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型失敗。給藥前，動(dòng)物需要徹底空腹禁食，一般都是禁食12 h以上。

選擇用STZ誘導(dǎo)小型豬要考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、給藥途徑及方法、給藥劑量等。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇方面，最好用雄性動(dòng)物造模，雌性除了激素影響外，還要注意在實(shí)驗(yàn)時(shí)不要混入雄性，雌雄混養(yǎng)，容易導(dǎo)致妊娠，影響實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重開(kāi)始建模時(shí)不能太低，因?yàn)橐坏┏赡＃w重幾乎是負(fù)增長(zhǎng)，文獻(xiàn)多選用體重為20～25 kg的小型豬來(lái)誘導(dǎo)建模。給藥途徑有腹腔注射，靜脈注射，皮下注射等。皮下注射很少見(jiàn)，腹腔注射操作簡(jiǎn)單，方便快捷，但一般多用于鼠類建模中。小型豬一般多主張快速靜脈注射，多采用耳緣靜脈注射。方法有一次性大劑量，一次性小劑量和多次小劑量等均可造成糖尿病。STZ的劑量與血糖的高低有關(guān)，一般一次性大劑量直接會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞的廣泛破壞，造成1型糖尿??；小劑量只破壞部分β細(xì)胞，造成外周組織對(duì)胰島素不敏感，接近于人類2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理。由于一次性大劑量藥物的毒性太大，可以平均分成多次小劑量的注射，這樣減少藥物毒性，有助于建模，提高成模率。因STZ的水溶液不穩(wěn)定，注射時(shí)要迅速最好在30 min內(nèi)注射完，否則藥效會(huì)降低。建模時(shí)除了把握藥物的劑量外，還要參考實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡、體重、對(duì)藥物的承受能力以及不同物種間對(duì)藥物的敏感程度。Didier Mesangeau等［5］用5月齡、體重為（17.8±0.45）kg的Yucatan小型豬，第一次注射55 mg/kg劑量的STZ，8 d后又按照50 mg/kg的劑量再次注射STZ，如果血糖過(guò)高，平均一天2次注射10～20單位的胰島素，成功誘導(dǎo)出1型糖尿病。成模后糖尿病組血糖與正常組相比顯著并且持續(xù)升高，體重明顯下降。Ross G等［6］用年齡為8～12周齡體重為15～20 kg的Yorkshire小型豬按照50 mg/kg的劑量通過(guò)耳緣靜脈連續(xù)3d注射STZ，再用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出糖尿病。在注射STZ后的2 d內(nèi)空腹血糖達(dá)到最高，之后會(huì)緩慢降下來(lái)。注射STZ后的20周，胰島β細(xì)胞為43±10與正常組221±86比較減少了20％。國(guó)內(nèi)Lu Lin等［7］用4～6月齡平均體重為20～30 kg的雄性貴州小型豬，按照125 mg/kg的STZ劑量成功誘導(dǎo)出糖尿病模型，糖尿病組的空腹血糖在注射STZ后的2～3個(gè)月后急劇上升，之后會(huì)逐漸降下來(lái)。6個(gè)月后空腹血糖糖尿病組（7.09±4.11） mmol/L與正常組（2.19±0.78）mmol/L相比差異有顯著性；胰腺的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，正常組的胰腺有許多β細(xì)胞團(tuán)存在，而糖尿病組的胰腺β細(xì)胞團(tuán)幾乎沒(méi)有，僅有殘余的小的β細(xì)胞存在。M Jensen-Waern等［8］用6月齡平均體重為（19±1.3） kg的家豬來(lái)誘導(dǎo)糖尿病，一次性注射STZ150 mg/ kg，成功誘導(dǎo)出高血糖癥且氨基酸代謝改變。注射STZ 9 h后，血糖由原來(lái)的（5.4～7.5）mmol/L下降到（0.8～2.2）mmol/L，血糖太低注射0.5 g/kg的葡萄糖。在24 h后所有實(shí)驗(yàn)豬出現(xiàn)高血糖，3 d后空腹血糖值大于25 mmol/L.C肽平均值為（0.25± 0.16）μg/L，血清支鏈氨基酸的濃度增加4倍，丙氨酸和?；撬岱謩e降低了70％和50％。所有實(shí)驗(yàn)豬除了生長(zhǎng)阻滯和骨骼肌減少外體格檢查均正常，最后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物消瘦，尸檢證明肌肉消耗，腹部肌肉減少和皮下脂肪減少。Von W ilmowsky C等［9］用家豬注射90 mg/kg的STZ就可以誘導(dǎo)出具有明顯特征的糖尿病模型，其6個(gè)月后軟骨和硬骨的骨組織病理特征發(fā)生改變。Lee PY等［10］在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小型豬中對(duì)胰腺蛋白進(jìn)行雙向電泳檢測(cè)，與對(duì)照組相比，糖尿病組發(fā)現(xiàn)了11個(gè)蛋白與正常組有顯著區(qū)別。此關(guān)于胰腺蛋白質(zhì)組學(xué)的研究數(shù)據(jù)將為研究1型糖尿病病理機(jī)理過(guò)程提供有價(jià)值的資源。

尼克酰胺的作用是保護(hù)部分β細(xì)胞，以緩沖STZ對(duì)β細(xì)胞造成的損傷。Marianne O.larsen等［11］用G?ttingen小型豬建立糖尿病模型，他用平均體重為（18±3）kg的小型豬單獨(dú)注射不同劑量的STZ （0，75，100和125 mg/kg）誘導(dǎo)糖尿病或者用平均體重為（22.5±3.5）kg的小型豬注射劑量為125 mg/ kg的STZ結(jié)合不同劑量的尼克酰胺（0，20，67，100，150和230 mg/kg）進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果單獨(dú)注射不同劑量的STZ，以100和125 mg/kg的劑量是最好的，空腹血糖和胰島素與正常組相比都有顯著變化；注射125 mg/kg的STZ和不同劑量的尼克酰胺，以67 mg/kg的尼克酰胺為最佳，此劑量的藥物在注射前與注射后相比較都有顯著的變化。隨后幾年他用同樣劑量125 mg/kg的STZ和67 mg/kg的尼克酰胺也誘導(dǎo)出了糖尿病模型［12，13］。此種方法建立的模型有利于糖尿病病理生理學(xué)的研究，并且為治療糖尿病篩選新的藥物提供幫助。

有文獻(xiàn)報(bào)道，用STZ誘導(dǎo)糖尿病血糖會(huì)出現(xiàn)3個(gè)時(shí)期的變化：早期的高血糖時(shí)期，大約持續(xù)1～2 h，可能是由于藥物抑制了胰島β細(xì)胞釋放胰島素所致；低血糖時(shí)期，大約持續(xù)6～10 h，可能是因?yàn)樗幬锲茐牧艘葝uβ細(xì)胞，使胰島素大量釋放所致；最后大約72個(gè)h后就是穩(wěn)定持續(xù)的高血糖時(shí)期即糖尿病階段。在注射STZ后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)短暫性的飲食減少，飲水增加，多尿，活動(dòng)反應(yīng)差，精神不振等癥狀，大約持續(xù)1周。所以要保持給予充足的水源，棲息地墊草料，要保持清潔衛(wèi)生，溫度要適中，此期間要隨時(shí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血糖。嚴(yán)重的低血糖是要補(bǔ)充葡萄糖，高血糖時(shí)要補(bǔ)充胰島素。也有文獻(xiàn)報(bào)道，在注射STZ一個(gè)月后血糖不但沒(méi)有升高，反而和之前血糖不相上下甚至低于之前血糖水平，這可能是與STZ的劑量有關(guān)，STZ的劑量不夠，胰島β細(xì)胞發(fā)生代償性反應(yīng)，胰島β細(xì)胞增生，胰島素分泌增加所致。這種情況下，只有等血糖恢復(fù)正常水平后再次注射STZ。

3 小型豬糖尿病模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)

小型豬的糖代謝血液生化指標(biāo)與人類十分相似，血清胰島素和葡萄糖的正常值接近于人類，糖耐量實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)過(guò)程也與人類相近，因此，小型豬的判斷標(biāo)準(zhǔn)可以參考人類的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。2010年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)發(fā)布了人類糖尿病診斷的新標(biāo)準(zhǔn)［14］，該標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）A1C≧6.5％。（2）空腹血糖（FPG）≧7.0 mmol/L，空腹的定義是至少8 h未攝入熱量。（3）口服糖耐量（OGTT）實(shí)驗(yàn)中2 h的血糖≧11.1 mmol/L。實(shí)驗(yàn)應(yīng)按照世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，用75 g無(wú)水葡萄糖溶于水中作為糖負(fù)荷。（4）有高血糖的癥狀或高血糖危象，隨機(jī)血糖≧11.1 mmol/L。因?yàn)樾⌒拓i在糖耐量試驗(yàn)中不會(huì)像人一樣配合，所以可以采用靜脈糖耐量（IVGTT）來(lái)代替OGTT。Berit Chistoffersen等［15］比較了幾種反應(yīng)小型豬胰島素敏感性的實(shí)驗(yàn)方法，最后指出IVGTT優(yōu)于其它幾種方法。

4 選擇小型豬制備糖尿病模型的優(yōu)勢(shì)

目前全球糖尿病患者日益增加，病因不清楚，誘發(fā)因素很多，對(duì)糖尿病研究使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也很多，如靈長(zhǎng)類的獼猴，用它研究糖尿病更接近于人類，但是價(jià)格比較昂貴；也有嚙齒類動(dòng)物，如小鼠、大鼠等，雖然價(jià)格適中，但是他們的功能器官與人類還是有一定的差距?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外用小型豬來(lái)做糖尿病模型的越來(lái)越多，這主要是因?yàn)樾⌒拓i與人類的功能器官很接近，胰島素肽鏈氨基酸的組成和人類最相近，只相差一個(gè)氨基酸（β鏈第30位氨基酸，豬是丙氨酸，人是蘇氨酸［16］）；心血管系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展，形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特征與人類相差不大［17］；再者豬與人類一樣都是雜食性動(dòng)物，自身的糖代謝、脂代謝的特點(diǎn)也與人類極為相似［18］。此模型與鼠等動(dòng)物模型相比，豬與人在皮下藥物管理、胃腸的結(jié)構(gòu)、胰島的形態(tài)與代謝狀態(tài)存在相似的藥物動(dòng)力學(xué)；還可以做糖尿病胰腺移植的相關(guān)研究，為糖尿病的治療提供一種方法；歐洲的G?ttingen小型豬已被公認(rèn)為最佳的醫(yī)用模式動(dòng)物之一，目前可作為糖尿病、心臟病、高血壓等重大疾病的動(dòng)物模型和新藥刪選模型，所以豬是研究糖尿病及其并發(fā)癥的理想動(dòng)物。

5 展望

由于小型豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、血液學(xué)和血液生化指標(biāo)值、疾病發(fā)生過(guò)程等方面都與人極為相似，因此不僅應(yīng)用于糖尿病模型，還廣泛用于心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)、骨骼發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)代謝等方面。而且應(yīng)用數(shù)量正在逐年增加，有可能會(huì)取代實(shí)驗(yàn)猴、犬成為被大量使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在心血管系統(tǒng)方面，豬的心臟大小和血液循環(huán)與人類很相似，堵塞冠狀動(dòng)脈分支后形成的心肌梗死模型與人類的心肌梗死病變過(guò)程有很大的相似，對(duì)臨床研究心肌梗死的病理生理以及治療方法有重要意義；小型豬的營(yíng)養(yǎng)吸收和胃腸道結(jié)構(gòu)與人類相似，所以用小型豬制作消化系統(tǒng)疾病模型與其他同類動(dòng)物模型相比有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)；在皮膚系統(tǒng)方面，豬皮膚的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)與藥理學(xué)與人類相似，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)燒傷研究的理想動(dòng)物；隨著移植醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)的深入研究，到現(xiàn)在為止，小型豬已被選為最適合的異種移植供體，小型豬-人異種器官/細(xì)胞的移植已經(jīng)是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)；另外小型豬在一些藥物的代謝動(dòng)力學(xué)方面比其他動(dòng)物更能反映藥物在體內(nèi)的情況，因此，小型豬越來(lái)越多的被用于藥物代謝動(dòng)力學(xué)方面的相關(guān)研究。由此可見(jiàn)，小型豬做為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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