張曉坤 黎文成 古雅玨 楊曉?xún)x

（廣州醫(yī)學(xué)院荔灣醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510140）

近10年來(lái)，對(duì)同型半胱氨酸（Homocysteine，HCY） 的研究取得了很大的進(jìn)展，研究表明HCY是一種被認(rèn)為與心血管、糖尿病、腎臟等疾病有密切關(guān)系的指標(biāo)，并認(rèn)為與傳統(tǒng)的指標(biāo)相比，Hcy具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值，Hcy的測(cè)定對(duì)預(yù)防和治療心血管疾病有重要的臨床意義。近年來(lái)，越來(lái)越多的臨床和基礎(chǔ)研究證據(jù)顯示同型半胱氨酸（HCY）是心腦血管以及周?chē)茏枞约膊〉莫?dú)立危險(xiǎn)因素[1]。目前，測(cè)定同型半胱氨酸的方法有很多種，包括高效液相色譜法（HPLC）、氨基酸分析儀法、熒光偏振免疫分析（FPIA）[2]和放射性酶聯(lián)免疫吸附法[3]、酶學(xué)分析法。其中HPLC法是最常用的方法，但是需要特殊設(shè)備，操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，不易在普通實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開(kāi)展，為此，我們用酶轉(zhuǎn)換法測(cè)定血清中的HCY濃度，并對(duì)此方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀器

日立7180型全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 試劑

酶轉(zhuǎn)換法試劑由上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司提供同型半胱氨酸檢測(cè)試劑，包括試劑1：Tris緩沖液（50mmol/L）；試劑2：FeCl3（50mmol/L）；同型半胱氨酸酶：同型半胱氨酸酶（500U/L），5-磷酸吡哆醛（5mmol/L），Tris緩沖液（50mmol/L）。還原劑：二硫蘇糖醇（5mmol/L），二乙基對(duì)苯二胺硫酸鹽（2mmol/L）；校準(zhǔn)液：以混合人血漿為基質(zhì)，同型半胱氨酸濃度為40μmmol/L，濃度賦值的計(jì)量學(xué)溯源性為NIST SRM 1955；質(zhì)控品L：以混合人血漿為基質(zhì)，同型半胱氨酸濃度為8～12μmmol/L，濃度賦值的計(jì)量學(xué)溯源性為NIST SRM 1955；質(zhì)控品H：以混合人血漿為基質(zhì)，同型半胱氨酸濃度為16～24μmmol/L，濃度賦值的計(jì)量學(xué)溯源性為NIST SRM 1955。

1.3 酶轉(zhuǎn)換法測(cè)定原理

樣品中的氧化型同型半胱氨酸首先被還原劑二硫蘇糖醇還原為還原型同型半胱氨酸，還原型同型半胱氨酸其后被特異性極高的基因重組同型半胱氨酸酶分解，分解產(chǎn)物硫化氫在氧化劑FeCl3存在下與呈色劑二乙基對(duì)苯二胺硫酸鹽反應(yīng)形成甲基藍(lán)色化物，甲基藍(lán)色化物與樣品中同型半胱氨酸的濃度呈正比，通過(guò)在波長(zhǎng)660nm處測(cè)定吸光度的變化值，即可測(cè)得樣品中同型半胱氨酸的總濃度。

1.4 測(cè)定方法及條件

終點(diǎn)法；溫度37℃，主波長(zhǎng)669nm，副波長(zhǎng)700nm，吸光度范圍0～2A，比色杯光徑1.0cm，反應(yīng)方向?yàn)樯磻?yīng)，樣品量200μL，工作試劑1用量2000μL，孵育時(shí)間為5min，試劑2用量300μL，反應(yīng)時(shí)間5min，校準(zhǔn)模式為兩點(diǎn)定標(biāo)。

1.5 樣品來(lái)源

門(mén)診健康體檢者120例，年齡18～65歲，其中男性69例，女性51例，體檢結(jié)果正常、肝腎功能試驗(yàn)等各項(xiàng)理化指標(biāo)正常，抽血前禁食8～12h。血樣采集用EDTA抗凝，20min內(nèi)分離血漿，同時(shí)，采集靜脈血凝固后立即分離血清，血漿及血清置－20℃保存待檢。

1.6 熒光偏振免疫法（FPIA）測(cè)定HCY濃度（采用美國(guó)雅培Abbott公司AXSYM型全自動(dòng)分析儀及配套FPIA檢測(cè)HCY試劑盒）

根據(jù)樣品中游離HCY和單克隆抗體結(jié)合HCY的熒光偏振強(qiáng)度不同，將樣品，標(biāo)準(zhǔn)液與抗體結(jié)合，采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的原理制作出HCY濃度與熒光偏振強(qiáng)度倒數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其HCY的濃度。

1.7 高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定HCY濃度（參考有關(guān)文獻(xiàn)方法[4]）

先使用還原劑使血樣中所有形式的HCY轉(zhuǎn)變成還原形式，然后與熒光試劑進(jìn)行衍生生成HCY－熒光物質(zhì)復(fù)合物，將衍生后的樣品進(jìn)行色譜分析。因色譜法的固定相對(duì)不同物質(zhì)吸附力不同，因此流動(dòng)相將其洗脫下來(lái)的次序也不同，根據(jù)這一原理將樣品中的不同物質(zhì)分開(kāi)，以熒光檢測(cè)器檢測(cè)洗脫下來(lái)的HCY-熒光物質(zhì)復(fù)合物的熒光度，將其與標(biāo)準(zhǔn)液/內(nèi)標(biāo)的比值進(jìn)行比較和計(jì)算，就可以測(cè)定血樣中總HCY的水平。

1.8 精密度測(cè)定

按照NCCLS（EP5-T2）文件的評(píng)價(jià)方案，取10μmol/L和40μmol/L的同型半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)液各一份，用酶轉(zhuǎn)換法將此兩份標(biāo)本每天上午、下午雙份測(cè)定，連續(xù)20d。

1.9 回收試驗(yàn)

取2份200μL血清樣品，其中一份中加入40μL40μmol/L的HCY標(biāo)準(zhǔn)液，充分混勻后，2份樣品各取50μL測(cè)定，求回收率。

1.10 線(xiàn)形試驗(yàn)

配制HCY濃度為2、5、10、20、40μmol/L的參考物，用本法測(cè)定，理論值（X）與測(cè)定值（Y）之間作線(xiàn)性回歸。

1.11 干擾試驗(yàn)

以濃度為20μmol/L的HCY為基礎(chǔ)血清，加入不同濃度的干擾物。

1.12 方法對(duì)比試驗(yàn)

選擇HCY濃度在3～98.0μmol/L的臨床血清標(biāo)本40份，用本法（Y）分別和熒光偏振免疫法（X1）及高效液相色譜法（X2）測(cè)定，每份樣品作雙份測(cè)定，結(jié)果取均值，按NCCLS EP9文件的評(píng)價(jià)方案統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.13 參考范圍制定

門(mén)診健康體檢者120例，年齡18～65歲，其中男性69例，女性51例，體檢結(jié)果正常、肝腎功能試驗(yàn)等各項(xiàng)理化指標(biāo)正常，抽血前禁食8～12h，抽取空腹靜脈血分離血清測(cè)定。

1.14 血清與血漿標(biāo)本HCY測(cè)定結(jié)果比較

隨機(jī)同時(shí)留取30份血清與血漿標(biāo)本，分別進(jìn)行HCY測(cè)定，并比較測(cè)定結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 精密度

批內(nèi)CV分別為2.5%、2.9%；日間CV分別為3.9%、4.5%，總CV分別為5.2%、5.6%。

2.2 回收實(shí)驗(yàn)

測(cè)得其回收率為104.2%。

2.3 線(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 理論值（X）與測(cè)定值（Y）之間的線(xiàn)性回歸

Y=0.99X+0.61，R2=0.99，HCY濃度在2～40.0μmol/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明，血氨＜50.0μmol/L，三酰甘油＜11.0 mmol/L，抗壞血酸＜10.0mmol/L，膽紅素＜500.0μmol/L，血紅蛋白＜2.0g/L，谷胱甘肽＜0.05mmol/L時(shí)，偏差均＜5.0%，說(shuō)明上述濃度的物質(zhì)無(wú)明顯干擾。

2.5 方法比較

與FPIA比較：X=13.9μmol/L，Y=13.2μmol/L，Y=0.97X－0.22，R2=0.93，配對(duì)t檢驗(yàn)得t=2.01，P＞0.05，與FPIA差異無(wú)顯著性，所測(cè)HCY值具有良好相關(guān)性（r＝0.98，P＜0.01）；與HPLC比較：X＝12.98μmol/L，Y=13.2μmol/L；Y=0.91X+1.87，R2=0.97，配對(duì)t檢驗(yàn)得t＝1.95，P＞0.05，與HPLC法差異無(wú)顯著性，所測(cè)HCY值具有良好相關(guān)性（r＝0.97，P＜0.01）。

2.6 參考值范圍

健康體檢者血清HCY參考值：男性（11.74±4.08）μmol/L；女性參考值：（8.96±3.11）μmol/L。

2.7 血清與血漿標(biāo)本HCY測(cè)定結(jié)果比較

血清與血漿結(jié)果分別為（18.87±9.78）μmol/L與（18.13±9.42）μmol/L，二者差異無(wú)顯著意義（t＝0.23，P＞0.05），血清與血漿結(jié)果之間具有良好相關(guān)性（r＝0.98，P＜0.01）。

3 討 論

HCY為含巰基氨基酸，是胱硫醚和蛋氨酸轉(zhuǎn)硫化和甲基化代謝旁路中形成的中間體。80%的同型半胱氨酸在血中通過(guò)二硫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，只有很少一小部分游離同型半胱氨酸參加循環(huán)。自20世紀(jì)60年代初在尿中首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，同型半胱氨酸被認(rèn)為與多種先天性代謝缺限有關(guān)，如胱硫醚β合成酶缺乏是已知的造成高同型半胱氨酸尿癥的原因。最近，人們又發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥是發(fā)生外周血管、腦血管和冠狀動(dòng)脈血管疾病的危險(xiǎn)因素之一，同型半胱氨酸不僅可影響脂類(lèi)代謝，還可通過(guò)多種其他途徑誘發(fā)心血管疾病。據(jù)調(diào)查，相當(dāng)大比例的人群面臨高同型半胱氨酸血癥的危險(xiǎn)，尤其是當(dāng)食物中葉酸和維生素B12攝入不足時(shí)更是如此。這些說(shuō)明，遺傳因素、環(huán)境因素、葉酸及維生素B12攝取量都與同型半胱氨酸血癥有關(guān)[5]。

研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格控制高糖血癥和高血壓及脂代謝紊亂等傳統(tǒng)致動(dòng)脈粥樣硬化（AS）危險(xiǎn)因子不能完全阻止2型糖尿病（T2DM）大血管病變的發(fā)生、發(fā)展。高HCY血癥可能是2型糖尿病合并早期動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，高Hcy血癥與T2DM血管病變相關(guān)性加重了T2DM血管病變的發(fā)生和進(jìn)展，加重了冠心病的危險(xiǎn)性，這種危險(xiǎn)性獨(dú)立于年齡、T2DM病程之外。因此，對(duì)T2DM患者常規(guī)檢測(cè)血HCY具有重要臨床意義[6]。

血清同型半胱氨酸濃度測(cè)定的常規(guī)化與自動(dòng)化近年來(lái)受到廣泛重視，測(cè)定同型半胱氨酸的常用方法是高效液相色譜（HPLC），還有熒光偏振免疫分析（FPIA）和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)酶轉(zhuǎn)換法在全自動(dòng)生化分析儀上以終點(diǎn)法檢測(cè)血清中同型半胱氨酸含量，結(jié)果顯示具有良好的精密度，批內(nèi)CV分別為2.5%、2.9%；日間CV分別為3.9%、4.5%，總CV分別為5.2%、5.6%；回收率在（100±10）%范圍內(nèi)，說(shuō)明方法可靠；線(xiàn)性范圍寬，HCY濃度在2～40.0μmol/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好；抗干擾因素強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確；血清與血漿結(jié)果之間具有良好相關(guān)性；與HPLC法及FPIA法所測(cè)HCY結(jié)果比較具有良好的相關(guān)性。顯示此方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，線(xiàn)性范圍寬，抗干擾因素強(qiáng)，精密度較好，不需特殊的設(shè)備，影響因素少，可以滿(mǎn)足大批量標(biāo)本的常規(guī)與自動(dòng)化分析，由于目前自動(dòng)化生化分析儀在國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院已經(jīng)普及，所以酶轉(zhuǎn)換法測(cè)定血清HCY含量是一種值得推廣的常規(guī)檢測(cè)方法。

[1] 陳健,張金枝,程龍獻(xiàn).高同型半胱胺酸血癥:心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[J].血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2000,9(1):2.

[2] 徐文華,唐樂(lè)莉,葛銀林.熒光偏振法測(cè)定血漿同型半胱氨酸的方法學(xué)評(píng)價(jià)[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2005,20(4):321-323.

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[4] 郭健,肖飛.高效液相色譜法測(cè)定血漿同型半胱氨酸[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2000,23(4):217-219.

[5] 季福綏,范海榮,孫福成,等.老年人亞甲基四氫葉酸還原酶、蛋氨酸合成酶基因多態(tài)性及同型半胱氨酸水平與冠心病的關(guān)系[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2004,23(6):376-379.

[6] 陳樹(shù)蘭,賈紹斌.同型半胱氨酸與冠心病的相關(guān)性及其機(jī)制研究[J].中華心血管病雜志,2002,30(9):520.