楊 瑋 徐道華

(廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 湛江 524023)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal cells，MSCs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種易于擴(kuò)增、具有多種分化潛能的細(xì)胞，在不同的誘導(dǎo)條件下，能夠向成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等不同的細(xì)胞系分化〔1〕。MSCs的成骨分化受到多重信號通路的調(diào)控，如何定向誘導(dǎo)其成骨分化是解決骨組織工程中種子細(xì)胞來源的一個重要前提。近年來的報道稱Wnt經(jīng)典途徑對生理成骨是必需的〔2〕。無論Wnt信號分子的表達(dá)增強(qiáng)還是Wnt抑制因子的缺失都將導(dǎo)致骨形成的增強(qiáng)。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LPR5)獲得性功能突變會導(dǎo)致高骨量表型，而缺失性功能突變將引起骨質(zhì)疏松〔2〕。另外骨髓腔內(nèi)的成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞均來源于MSCs，二者具有相同的細(xì)胞表型，在一定條件下可以互相轉(zhuǎn)換，并且存在彼消此長的關(guān)系〔3〕。很多轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞內(nèi)信號通路調(diào)節(jié)兩者的分化。比如，成骨分化主要受runx相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runx-2)的控制，而過氧化物酶增殖體激活受體(PPARγ)則是主要的成脂因子〔4〕。

1 Wnt信號通路研究簡介

目前，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)19種Wnt基因，分別命名為Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a等等。它們編碼的 Wnt蛋白分子大約包括350～400個氨基酸〔5〕，且都帶有一段由23～24個半胱氨酸構(gòu)成的保守區(qū)，這些區(qū)域顯示出20% ～80%的同源性。Wnt蛋白合成后，經(jīng)由糖蛋白修飾，與人卷曲蛋白Fzd結(jié)合〔6〕。這一受體家族現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)10個成員，分別由500～700個氨基酸組成。Fzd的共受體，即低密度脂蛋白相關(guān)受體，LPR5和LPR6是分別含有1 615和1 613個氨基酸的跨膜蛋白。Fzd亦可與單跨膜的酪氨酸激酶樣跨膜受體(ROR2)結(jié)合〔7〕。Wnt蛋白與膜受體結(jié)合后可導(dǎo)致下游信號的激活，產(chǎn)生不同的生物學(xué)作用。這一信號通路包括三條途徑:經(jīng)典 Wnt/β-連環(huán)蛋白(βcatenin)通路、Wnt/Ca2+和Wnt/平面細(xì)胞極化(PCP)通路，后兩者又合稱為非經(jīng)典信號途徑。

2 經(jīng)典Wnt信號通路與MSCs成骨分化

2.1 經(jīng)典Wnt信號通路 經(jīng)典信號通路包括一個重要的調(diào)節(jié)子β-catenin。當(dāng)缺乏 Wnt配體時，β-catenin與核心蛋白(Axin)!大腸腺瘤樣蛋白(adenmatous polyposis coli，APC)結(jié)合后被酪蛋白激酶 Iα(CKIα)和糖原合成激酶 3β(GSK3β)磷酸化〔8〕，最終被泛素/蛋白激酶途徑降解。這樣一來，β-catenin就無法激活轉(zhuǎn)錄過程，T細(xì)胞因子(TCF)與抑制子組蛋白去乙?；?HDAC)作用，抑制 Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄〔9〕。

若Wnt蛋白與共受體Fzd，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP5/6)結(jié)合，胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)因子(Dvl)將被CKIε磷酸化，LRP5/6-體軸發(fā)育抑制因子(Axin)-FRAT復(fù)合物形成后將Axin降解〔10〕，β-catenin就從 APC-Axin-GSK3β 復(fù)合物上解離了下來，避免了被分解的命運。這樣一來，積累的β-catenin就會與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，活化Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。

2.2 經(jīng)典Wnt信號通路在MSCs成骨分化中的作用 經(jīng)典Wnt信號通路對MSCs成骨分化的促進(jìn)、抑制作用均見報道。最初有人發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典通路共受體LRP5的功能突變引起骨量改變，即LRP5缺失性功能突變導(dǎo)致骨量減少和家族性骨質(zhì)疏松，而LRP5獲得性功能突變將形成高骨密度表型〔11〕。接著又有β-catenin信號促進(jìn)了MSCs成骨分化的報道出現(xiàn)〔12〕。后來，在TCF上發(fā)現(xiàn)存在Runx2啟動子的活化激活位點，猜測β-catenin/TCF/LEF復(fù)合物可能對Runx2的表達(dá)有一定作用〔13〕。

Boland〔14〕與 Boer等〔15〕分別發(fā)現(xiàn)，含有 Wnt3a 的條件培養(yǎng)基或經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a都將強(qiáng)烈抑制人MSCs成骨分化。外源性的Wnt1也可急劇下調(diào)成骨標(biāo)志物的表達(dá)〔15〕，如堿性磷酸酶，骨鈣素等。這一結(jié)果與先前發(fā)現(xiàn)的Wnt通路在體內(nèi)骨動態(tài)平衡中的陽性作用相矛盾。Ross等〔16〕發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路亦可抑制成脂分化。那么，是否在經(jīng)典Wnt通路中，人MSCs更傾向于成骨分化，這仍然是一個有待解決的問題。Liu等〔17〕發(fā)現(xiàn)100 ng/ml Wnt3a可不完全抑制成骨，而在含有25 ng/ml Wnt3 a的培養(yǎng)基中則完全觀察不到堿性磷酸酶(ALP)活性或礦化抑制的現(xiàn)象。相形之下，Wnt3 a抑制成脂分化的能力似乎更強(qiáng)烈一些，5 ng/ml就可達(dá)到40%的抑制率，100 ng/ml則可達(dá)到完全抑制。在含有Wnt蛋白的雙向(成脂成骨)培養(yǎng)基中，Liu等〔17〕比較了人MSCs成脂成骨的敏感性，結(jié)果表明，人MSCs成脂成骨敏感性的不同將改變原有的平衡狀態(tài)，有可能使得人MSCs更傾向于成骨方向分化。Kahler等〔18〕發(fā)現(xiàn)Wnt經(jīng)典通路對成骨的抑制作用歸根結(jié)底是β-catenin-Lef復(fù)合物對Runx2轉(zhuǎn)錄活性的抑制。但Gaur等〔13〕在鼠MSCs中又發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin增加了Runx2水平。Liu等〔17〕的結(jié)論是高濃度的Wnt蛋白將下調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。因此得出結(jié)論:體外實驗中，Wnt經(jīng)典途徑對人MSCs的成脂成骨的調(diào)節(jié)能力與細(xì)胞所處的微環(huán)境中Wnt蛋白的含量有關(guān)。可以肯定的是，通過對Wnt蛋白的適當(dāng)調(diào)節(jié)，可達(dá)到控制人MSCs的成脂成骨分化的目的。另外，Wnt蛋白作用下MSCs成脂成骨敏感性的不同，也為一定濃度的Wnt蛋白可抑制MSCs成脂分化，傾向成骨分化提供了依據(jù)。

3 非經(jīng)典Wnt信號通路與MSCs成骨分化

3.1 非經(jīng)典Wnt信號通路簡介 非經(jīng)典Wnt信號通路即βcatenin非依賴途徑，主要作用于細(xì)胞的運動和極化過程，包括Wnt/PCP及Wnt/Ca2+通路。Wnt/PCP通路主要包含在個體發(fā)育過程中，包括蛋白酪氨酸激酶(JAK)/STAT信號的激活。這一途徑中的Wnt5a、Wnt11和 Wnt7a與Fzd、ROR2相互作用，并結(jié)合散亂蛋白(Dsh)使得Vang、Prickle募集至細(xì)胞膜處，通過 Jun、Daam、RhoA、Rac、細(xì)胞周期分裂基因(Cdc42)及微絲結(jié)合蛋白(Prolin)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，控制細(xì)胞的極化和運動〔18〕。Wnt/Ca2+通路涉及細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放，這一途徑中的Wnt蛋白包括Wnt5a，!Wnt11和Wnt4，它們與Fzd受體結(jié)合后，活化異源G蛋白，使膜上磷肌醇轉(zhuǎn)化，將鈣從貯存物中釋放出來〔19〕，隨著細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，鈣依賴信號分子比如鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶(CAMKⅡ)和蛋白激酶(PKC)〔19〕將會活化。非經(jīng)典通路中的Wnt5a分子可抑制經(jīng)典 Wnt途徑的活化，這一作用是通過CAMKⅡ激活E3泛素連接酶復(fù)合物(Sian)，致使β-catenin的降解來完成的〔13〕。準(zhǔn)確區(qū)分Wnt/Ca2+及Wnt/PCP通路比較困難，區(qū)分兩者是通過辨別它們下游的效應(yīng)分子，Jnk、Rac、Rho歸屬于PCP通路，而鈣及PKC納入Wnt/Ca2+范疇。

3.2 非經(jīng)典Wnt信號通路在MSCs成骨分化中的作用 相比經(jīng)典通路，非經(jīng)典Wnt通路對MSCs分化作用的研究相對較少。據(jù)報道，磷酸化的RhoA和ROCK蛋白對MSCs成骨性分化具有重要作用〔20〕，受體蛋白Ror2的過表達(dá)，導(dǎo)致Runx2和Osterix上調(diào)，而Ror2反義RNA可抑制MSC成骨分化〔21〕。

Chang等〔22〕發(fā)現(xiàn)Wnt4可增加人類顱面組織分離的MSCs的成骨活性，但Wnt4并不增加細(xì)胞內(nèi)β-catenin的水平，它激活另一新的非經(jīng)典信號通路，即p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和其他生長因子就是通過p38 MAPK通路誘導(dǎo)MSCs成骨分化。Axin的反義RNA將顯著降低Wnt4誘導(dǎo)的p38活化，表明Wnt4信號通過Axin發(fā)揮作用，而p38抑制劑將阻斷Wnt4激活的MSCs成骨分化。另外，使用不同的顱面骨損傷模型發(fā)現(xiàn)，表達(dá)Wnt4的MSCs將顯著更新骨組織，促進(jìn)顱面部修復(fù)。Arnsdorf等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a與MSCs譜系中成骨細(xì)胞的命運密切相關(guān)。RhoA酪氨酸激酶受體與Wnt5a結(jié)合后，激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，誘導(dǎo)Runx2和骨保護(hù)素的的表達(dá)，但骨鈣素的水平不受影響，這表明Wnt5a可能在干細(xì)胞成骨分化的早期階段發(fā)揮作用，但這一過程的完成還需其他因子的參與。

4 展望

Wnt經(jīng)典途徑對人MSCs成骨成脂的調(diào)節(jié)與細(xì)胞所處的微環(huán)境有關(guān)，Wnt4與Wnt5a均可激活成骨活化，但需要其他信號分子才能共同完成整個成骨分化過程。大面積骨損傷修復(fù)是一亟待解決的問題，而MSCs在再生醫(yī)學(xué)、組織工程及骨形成等方面的臨床應(yīng)用也是鮮有報道。有研究表明，若給予MSCs聯(lián)丁?；?cAMP(PKA通路的激活劑)，就能使異位成骨從1.5%提高到6%〔24〕。Wnt信號通路的闡明，將揭示MSCs成骨機(jī)制，為骨質(zhì)疏松治療提供新思路。

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