李晶，趙海燕 ，李鯤鵬

1.昆明總醫(yī)院 設(shè)備科，云南 昆明650032；2.云南省第一人民醫(yī)院 眼科，云南 昆明 650032；3.中山大學(xué)生物防治國家重點實驗室，廣東 廣州510275

生物大分子電子斷層三維重建與分子模擬技術(shù)

李晶1，趙海燕2，李鯤鵬3

1.昆明總醫(yī)院 設(shè)備科，云南 昆明650032；2.云南省第一人民醫(yī)院 眼科，云南 昆明 650032；3.中山大學(xué)生物防治國家重點實驗室，廣東 廣州510275

本文提出了生物大分子電子斷層三維重建與分子模擬技術(shù)，闡述了該技術(shù)的立論依據(jù)和需要研究的內(nèi)容。對該技術(shù)的深入研究有利于預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，為蛋白質(zhì)三維形態(tài)分析提供新的技術(shù)方法。

蛋白復(fù)合物；三維重建；三維分割；分子模擬

蛋白質(zhì)分子是由20種不同的氨基酸通過共價鍵連接而成的線性多肽鏈，每一種蛋白質(zhì)在天然條件下都有自己特定的空間結(jié)構(gòu)。但以一定氨基酸順序排列的多肽鏈?zhǔn)侨绾涡纬捎幸欢臻g結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子的？這個空間結(jié)構(gòu)中有著什么樣的規(guī)律？其有什么樣的變化和行為？這些均是近年來人們力圖解決的重要問題。

1 生物大分子結(jié)構(gòu)的測定方法

測定生物大分子結(jié)構(gòu)的主要方法有3種：X射線單晶衍射方法、核磁共振（NMR）方法和電子顯微學(xué)方法。X射線單晶衍射方法主要用于可結(jié)晶的生物大分子單體；NMR的方法通常使用于30kDa以下的生物分子；電子顯微學(xué)方法雖然無法直接得到生物大分子的三級結(jié)構(gòu)，但是它可以在較廣的尺度范圍內(nèi)獲得從生物大分子單體到復(fù)合物、組裝體的三維結(jié)構(gòu)。

電子顯微學(xué)主要包括3種技術(shù)：① 電子晶體學(xué)，這是最早發(fā)展起來的生物大分子三維重建技術(shù)，也是電鏡三維重建技術(shù)中分辨率最高的。這種技術(shù)要求對樣品進(jìn)行二維結(jié)晶，由于大多數(shù)樣品結(jié)晶是很困難的，所以限制了技術(shù)的應(yīng)用。② 單顆粒技術(shù)，其重建分辨率接近7.5A[1]，但這種技術(shù)要求樣品是全同性的，也限制了此技術(shù)的應(yīng)用和分辨率的進(jìn)一步提高；③ 冷凍電鏡電子斷層掃描技術(shù)（Cryo-Electron Tomography，CET），該技術(shù)分辨率不高,現(xiàn)在最高只有4～5nm[2]；但是該技術(shù)對樣品的要求最低，應(yīng)用范圍最廣，只要大小合適（10～200nm）即可[3]。對于部分非全同性的超分子復(fù)合體和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等一定尺度的生物結(jié)構(gòu)，這種技術(shù)是唯一的選擇。其次這種技術(shù)與低溫電子顯微術(shù)相結(jié)合，能夠?qū)悠愤M(jìn)行原位、非侵入性的研究。通過低溫技術(shù)能夠?qū)ι飿悠愤M(jìn)行高時間分辨的生化生理反應(yīng)定格，即可對在一定功能條件下的生物大分子的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。這種合成技術(shù)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究極為有效。對于它分辨率不足的缺點，可以通過分子模擬方法進(jìn)行解決。這就是本研究的基本思路：一方面是利用低溫技術(shù)、電子斷層掃描技術(shù)方法的優(yōu)點，發(fā)展出中等分辨率蛋白的三維重構(gòu)方法；另一方面，以三維重構(gòu)結(jié)果為基礎(chǔ)，加上分子生物學(xué)對序列的測定，建立預(yù)測生物大分子二、三級結(jié)構(gòu)的計算機(jī)模型，再結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)的定位技術(shù)，對蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行局部的三級結(jié)構(gòu)計算機(jī)分割、控制與計算。

分子模擬主要是指蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模擬，是利用計算機(jī)建立原子水平的分子模型來模擬分子的結(jié)構(gòu)與行為，進(jìn)而模擬分子體系的各種物理與化學(xué)性質(zhì)。利用分子模擬技術(shù)結(jié)合計算機(jī)圖形技術(shù)可以更形象、更直觀地研究蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的清晰表述和研究，對揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，總結(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的規(guī)律，預(yù)測蛋白質(zhì)肽鏈折疊和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等，都是有力的促進(jìn)。

2 國內(nèi)外電子顯微學(xué)研究進(jìn)展

國外在大分子蛋白電子顯微學(xué)研究方面，已經(jīng)開始研究具有非全同性的生物樣品的三維重建方法，更多地采用冷凍電鏡電子斷層掃描技術(shù)。美國顯微鏡和圖像研究國家中心應(yīng)用電子斷層掃描技術(shù)獲取大尺度生物樣品的結(jié)構(gòu)信息。歐洲分子生物學(xué)實驗室已開始用電子斷層掃描技術(shù)研究V-ATP酶以及與F-ATP酶相似的生物大分子的三維結(jié)構(gòu)[4-5]。Baylor醫(yī)學(xué)院研究相對分子量在300kDa～30MDa的生物大分子聚合體?，F(xiàn)在正應(yīng)用電子斷層掃描技術(shù)以直接觀察到生物大分子的多肽骨架[6-7]。Texas大學(xué)實驗室主要開發(fā)包括冷凍電鏡技術(shù)和計算機(jī)三維重構(gòu)方法[8-9]。在分子模擬方面，預(yù)測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的方法可以分為2大類：① 分子動力學(xué)方法；② 基于知識的預(yù)測方法。第一類方法在數(shù)學(xué)上遇到了難以解決的多重極小值問題，而第二類方法又受到預(yù)測精度的限制。近年來，國際上一些研究組發(fā)展了一些從蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)直接預(yù)測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的新方法：遺傳算法[10]、模擬退火[11]、多維統(tǒng)計[12]、模糊集合論方法[13]等，這些方法在對一些簡單蛋白質(zhì)分子的模擬研究中已經(jīng)顯示出強(qiáng)有力的作用，對復(fù)雜蛋白質(zhì)分子的模擬研究還有很多問題需要研究。

國內(nèi)電子顯微學(xué)三維重建研究相對于國外起步較晚，有中科院電鏡室、中科院生物物理所、武漢大學(xué)生科院、清華大學(xué)等在進(jìn)行電子顯微學(xué)方面研究工作[15-16]。研究的對象基本上是具有全同性和對稱性的生物樣品，如二十面體對稱的病毒顆粒，采用的是單顆粒技術(shù)。在圖像處理方面都是借助國外現(xiàn)成的軟件。在分子模擬方面國內(nèi)主要借助國外提供的軟件有Insight II和Quanta來進(jìn)行模擬應(yīng)用。

3 研究項目介紹

本項目選擇MCM（Minichromosome Maintenance）蛋白復(fù)合物、濃核病毒、登革病毒作為研究材料，原因是人類MCM蛋白復(fù)合物并不出現(xiàn)在正常的非增殖細(xì)胞中，僅僅在癌變細(xì)胞中獲得表達(dá)，可以作為特征標(biāo)記檢測癌變細(xì)胞或作為抗癌藥物的作用靶點[14]。濃核病毒、登革病毒也是動植物中非常重要的致病因子。在形態(tài)上MCM可以作為非全同性顆粒的代表。國內(nèi)部分實驗室，初步建立起蛋白質(zhì)電子晶體學(xué)技術(shù)和設(shè)備，初步建立起連續(xù)切片三維重構(gòu)技術(shù)，已經(jīng)得到一些病毒包括濃核病毒、登革病毒的三維結(jié)構(gòu)[17-20]，并初步完成MCM的表達(dá)與純化工作，為此項技術(shù)的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

本項目綜合國內(nèi)外的研究狀況，考慮各種技術(shù)的優(yōu)劣，提出應(yīng)用冷凍電鏡電子斷層掃描方法對大分子蛋白復(fù)合物進(jìn)行三維重建，并基于重建三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，進(jìn)行計算機(jī)分子模擬。這個方面的研究在世界范圍內(nèi)也是近幾年才起步，以人的MCM作為研究對象的電子斷層掃描的三維重建研究，基于CET方法電鏡數(shù)據(jù)分子模擬技術(shù)研究，尚未見報道；另外還有很多在結(jié)構(gòu)上與MCM相類似的生物大分子的三維結(jié)構(gòu)急待解析而又未能解析。建立冷凍電鏡電子斷層掃描三維重建技術(shù)，能實現(xiàn)對大分子蛋白復(fù)合物二、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，在分子水平上對蛋白質(zhì)任意局部分割，量化計算，控制改變?nèi)我饩植康目臻g位置。同時，這也能為疾病診斷與藥物的研制開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

[1] Yi zhi,Tao wei zhang,Recent developments in cryo-electron microscopy reconstruction of single particles[J].Current Opinion in Structural Biology,2000,(10):616-622.

[2] S Van Aert,A J,den Dekker,et al.High-resolution electron microscopy and electron tomography: resolution versus precision[J].Journal of Structural Biology,2002,(138):21-33.

[3] P A Thuman-Commike,W Chiu.Reconstruction principles of icosahedral virus structure determination using electron cryomic roscopy[J],Micron,2000,(31):687-711.

[4] Krebstakies T,Zimmermann B,Graber P,et al.Both rotor and stator subunits are necessary for efficient binding of F1 to F0 in functionally assembled Escherichia coli ATP synthase[J].J Biol Chem,2005,80(39):38-45.

[5] Zimmermann B,Diez M,Zarrabi N,et al.Movements of the epsilon-subunit during catalysis and activation in single membrane-bound H(+)-ATP synthase[J].EMBO J,2005,24(12):2053-2063.

[6] Jiang W,Chang J,Jakana J,et al.Structure of epsilon15 bacteriophage reveals genome organization and DNA packaging/injection apparatus[J].Nature,2006,439(7076):612-616.

[7] Paredes A, Weaver S, Watowich S,et al.Structural biology of old world and new world alphaviruses[J].Arch Virol Suppl,2005,(19):179-185.

[8] Cong Y,Jiang W,Birmanns S,et al.Fast rotational matching of single-particle images[J].Struct Biol,2005,152(2):104-112.

[9] Yu X, Shah S, Atanasov I,et al.Three-dimensional localization of the smallest capsid protein in the human cytomegalovirus capsid[J].Virol,2005,79(2):1327-1332.

[10] Yang H,Ahn JH,Ibrahim RK,et al.The three-dimensional structure of Arabidopsis thaliana O-methyltransferase predicted by homology-based modelling[J].Mol Graph Model,2004,23(1):77-87.

[11] Benaki DC,Mikros E,Hamodrakas SJ.Conformational analysis of peptide analogues of silkmoth chorion protein segments using CD,NMR and molecular modelling[J].Pept Sci,2004,10(6):381-392.

[12] Butterfield A,Vedagiri V,Lang E,et al.PyEvolve: a toolkit for statistical modelling of molecular evolution[J].BMC Bioinformatics,2004,5(1):1.

[13] T E Exner,M Keil,J Brickmann.Fuzzy Set Theory and Fuzzy Logic and Its Appliction to Molecular Recognition [J].Engel,T.(Eds.),Wiley-VCH,Weinheim,2003:1216-1238.

[14] The structure and function of MCM from archaeal[J].Thermoautotrophicum.Nat Struct Biol,2003,10(3):160-167.

[15] 王大能,陳勇,隋森芳.電子顯微學(xué)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的新進(jìn)展[J].電子顯微學(xué)報,2003,22(5):449-455.

[16] 鄭東,T Xue,諶東華,等.利用低溫電鏡術(shù)和像重構(gòu)方法研究兔出血癥病毒的三維結(jié)構(gòu)[J].科學(xué)通報,2001,46(1):39-43.

[17] Z Hong Zhou,Hong Zhang,Joanita Jakana,et al.Cytoplasmic polyhedrosis Virus Structure at 8A by Electron Crymicroscopy:Structural Basis of Capsid Stability and mRNA Processing Regulation[J].Structure,2003,(11):651-663.

[18] Hong,Zhang,Xue-Kui-Yu,Xing-Ying Lu,et al.Molecular Interaction and Viral Stabiligy Revealed by Structural Analyses of Chemically treated Cypovirus Capsids[J].Virology,2002,298:45-52.

[19] Zhang H,Zhang J,Yu X,et al.Visualization of protein-RNA interactions in cytoplasmic polyhedrosis virus[J].JOURNAL OF VIROLOGY,1999,73(2):1624-1629.

[20] Cheng Lingpeng,Zhou Zhenghong,Chen Senxiong,et al.The three dimensional structure determination of C6/36 DNV[J].SCIENCE IN CHINA(Series C),2004,34(1):75-79.

Three Dimensional Reconstruction from Cryoelectron Tomography of Biomacromolecules and Molecular Simulation Techniques

LI Jing1，ZHAO Hai-yan2，LI Kun-peng3
1.Equipment Department,Kunming General Hospital,Yunnan Kunming 650032,China; 2.Ophthalmology Department,Yunnan Province First People'sHospital,Y u n n a n Kunming 650032,China; 3.State Key Laboratory for Biocontrol,Sun Yatsen University,Guangzhou Guangdong 510275,China

The paper have put forward biomacromolecules protein complex three dimensional reconstruction from Cryoelectron tomography (CET) and molecular simulation by computer technique, its science base and arguments are studied in the paper. In-depth research in the field is help to forecast space structure of protein, and providing new way for three dimensional morphology analysis.

protein complex; three-dimensional reconstruction; three-dimensional segmentation;molecular simulation

TP301.6

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2011.08.018

1674-1633(2011)08-0058-02

2011-03-02

2011-04-18

國家自然科學(xué)基金（30770540）

趙海燕，主治醫(yī)師。

作者郵箱：li_jingkm@126.com