馮 慧， 馮成利， 劉曉農(nóng)， 任 軼

(陜西省動(dòng)物研究所， 陜西 西安 710032)

0 引 言

秦嶺山脈中有較多的動(dòng)物群，有些動(dòng)物已成為瀕危動(dòng)物，有些動(dòng)物兇狠不易靠近.為了發(fā)現(xiàn)瀕危動(dòng)物，人們?cè)谏矫}中去尋找，花費(fèi)了大量的人力物力，卻很難得到成效.有些地方發(fā)現(xiàn)有野生動(dòng)物的皮、肉出售，當(dāng)執(zhí)法部門(mén)檢查時(shí)，出售者稱(chēng)為人工養(yǎng)殖的，執(zhí)法人員很難區(qū)別人工養(yǎng)殖的還是野生動(dòng)物，這為執(zhí)法者提出了新課題.另外由于環(huán)境的變化，野生動(dòng)物也不停地進(jìn)行變異，通過(guò)DNA的推測(cè)可以發(fā)現(xiàn)動(dòng)物變異的規(guī)律.皮張標(biāo)本為DNA提取的材料是非損傷性取樣的一種，是法醫(yī)學(xué)、遺傳進(jìn)化和分子生態(tài)學(xué)研究的有效方法.館藏標(biāo)本取樣方便而且相對(duì)于糞便和毛囊的非損傷性取樣選材范圍較廣；還可利用不同年限的館藏標(biāo)本對(duì)動(dòng)物的遺傳變異及遺傳多樣性進(jìn)行研究分析，為制定相關(guān)的保護(hù)措施提供理論依據(jù)[1].為此，我們對(duì)秦嶺有蹄類(lèi)保護(hù)動(dòng)物遺傳多樣性及其變化進(jìn)行了研究.本論文是其中的一部分.

1 材料與研究方法

1.1 樣品采集與保存

首先采集陜西省動(dòng)物研究所標(biāo)本室內(nèi)20世紀(jì)5、60年代的林麝熟制標(biāo)本皮張和各森林公安送來(lái)的盜獵動(dòng)物的新鮮肉.新采集的樣品，放入冰袋低溫保存，及時(shí)分裝、貼標(biāo)，然后放入-80 ℃冰箱保存.

1.2 DNA的提取方法

試驗(yàn)進(jìn)行的同時(shí)使用抽提空管作為陰性對(duì)照，用新鮮肉做陽(yáng)性對(duì)照.

1.2.1 林麝熟制皮張DNA提取

(1)從每個(gè)標(biāo)本上剪取約0. 5 cm2的皮張，用1 mL 0.03 M Na2HPO4溶液在不斷振蕩條件下處理24 h，除去鉻離子[2].

(2)將標(biāo)本用浸泡液(10 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH8. 0)浸泡24 h，棄浸泡液，用剪刀盡量剪碎，置于1. 5 mL離心管內(nèi)；向離心管內(nèi)加入500μL Nuclei Lysis Sol′n(Promega)，24μL 0.5 M EDTA，3μL 20 mg/mL蛋白酶K，在55 ℃下存放 3～5 h.

(3)12 000 r/min離心5 min，取200μL上清液于另一離心管中；向離心管中加入200μL Tris-飽和酚(pH8. 0)，輕輕地?fù)u動(dòng)混合10 min， 12 000 r/min離心10 min，重復(fù)此步驟一次.

(4)將上清移至一個(gè)新的1. 5 mL離心管中，再加入200μL 氯仿，輕輕地?fù)u動(dòng)混合10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清并重復(fù)此步驟一次；取上清移入一個(gè)新的1. 5 mL離心管中，加入2. 5倍體積的冷無(wú)水乙醇，輕輕地?fù)u動(dòng)片刻，置于冰箱中于-20 ℃條件下冷凍3 h.

(5)13 000 r/min離心15 min，小心棄去上清；吸取200μL 70%乙醇洗滌片刻，13 000 r/min離心15 min，小心棄去上清，室溫下打開(kāi)離心管蓋，使乙醇蒸發(fā)10～20 min.

(6)用30μL TE (10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA，pH8. 0)緩沖液室溫下溶解DNA沉淀；用DNA定量提取純化試劑盒(DNA IQTM系統(tǒng)Promega)進(jìn)行二次提取[3].

為防止提取過(guò)程中外源DNA 的污染，用無(wú)菌濾紙代替皮質(zhì)標(biāo)本作陰性對(duì)照，提取方法與其它樣品完全一樣.

1.2.2 肌肉DNA提取

(1)剪取米粒大小肌肉組織，加入5% Chelex-100(Bio-Rad)懸濁液和2μL 20 mg/mL蛋白酶K，于56 ℃保溫過(guò)夜.

(2)第二天早上取出，劇烈震蕩5～10 s后，放入100 ℃震蕩8 min，再劇烈震蕩5～10 s.

(3)13 000 r/min離心3 min，取50μL上清液用于擴(kuò)增反應(yīng).

1.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1 紫外吸收與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

紫外吸收檢測(cè)DNA的純度：將提取后的DNA樣品適當(dāng)稀釋?zhuān)捎米贤夥止夤舛扔?jì)測(cè)定在波長(zhǎng)260 nm與280 nm處的吸收值，根據(jù)OD260/OD280值來(lái)判斷DNA的純度.

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性：將母液各取5 μL，采用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)降解程度，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)判斷分子大小，在凝膠成像儀上觀察并照相.

1.3.2 PCR擴(kuò)增

從皮張中提取的動(dòng)物基因組DNA往往要用于PCR擴(kuò)增等后續(xù)分子生物學(xué)操作[4]，DNA濃度和純度對(duì)結(jié)果影響較大, 因此提取的總DNA能否很好應(yīng)用于擴(kuò)增也是檢測(cè)DNA質(zhì)量的一個(gè)重要方面.根據(jù)NCBI上提供的林麝mtDNA Cytb區(qū)堿基序列，引物為L(zhǎng)：5′-CAACTAACCTCCCTAAGACTTCAAG-3′， H：5′-CCAAATGTATGACAGCACAGTTATG-3′.采用25μL反應(yīng)體積：10×緩沖液2.5μL，1.5μL MgCl2(25 mmol/L)，0.5μL dNTP(10 mmol/L)，引物(10μmol/L)各取1μL，0.5μL Taq DNA聚合酶(2 U/μL)，1μL模板總DNA.PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，68 ℃延伸1 min，35循環(huán)；68 ℃延伸10 min.反應(yīng)后4 ℃保存.

1.3.3 DNA擴(kuò)增片段的測(cè)序

PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，擴(kuò)增效果較好的樣品經(jīng)凝膠回收試劑盒回收后送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序.

2 結(jié)果與分析

紫外吸收值的結(jié)果顯示，熟制標(biāo)本皮張和新鮮肌肉提取到的DNA測(cè)得的OD260/OD280值均在1.75～1.85之間，這一結(jié)果表明熟制標(biāo)本皮張和新鮮肌肉都能提取到純度較高的DNA.

將提取到的DNA,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),加10μL DNA原液,結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖1可見(jiàn)，熟制標(biāo)本皮張DNA含量非常少，而且有降解現(xiàn)象；新鮮肉DNA沒(méi)有降解.

將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2.5個(gè)樣品中共有4個(gè)樣品有擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物量少，條帶亮度遠(yuǎn)低于新鮮肉擴(kuò)增產(chǎn)物.

圖1 皮張DNA和新鮮肉DNA電泳結(jié)果 圖2 皮張DNA和新鮮肉DNA Cytb擴(kuò)增結(jié)果

圖1中1為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量標(biāo)記，從上到下片段大小分別為2 000、1 000、750、500、250和100bp,每個(gè)條帶的DNA量為50 ng；2、3、4、5、9為熟制標(biāo)本皮張總DNA；6、7、8為新鮮肌肉總DNA.

圖2中1為DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量標(biāo)記，從上到下片段大小分別為2 000、1 000、750、500、250和100bp,每個(gè)條帶的DNA量為50 ng；2、3、4為肌肉mtDNACytb擴(kuò)增結(jié)果；5、7、8、9、10為熟制標(biāo)本皮張mtDNA擴(kuò)增結(jié)果；6為空白對(duì)照.

對(duì)4份有條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果均為400bp.與NCBI上林麝Cytb序列(GI:4 587 194)對(duì)比同源性為99%，說(shuō)明使用所提取出的DNA作模板時(shí), PCR擴(kuò)增并不受到微生物DNA的影響.

紫外吸收值測(cè)DNA濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)新鮮肌肉和熟制標(biāo)本皮張的OD值差不多，但擴(kuò)增和電泳結(jié)果表明熟制標(biāo)本皮張DNA含量明顯低于新鮮肌肉.由于熟制皮張核DNA多數(shù)已經(jīng)流失、降解，而且提取過(guò)程中雜質(zhì)不易清除，所以影響紫外吸收值.因此，標(biāo)本皮張DNA濃度不易用紫外吸收值來(lái)測(cè)定.

DNA-膠原蛋白形成的是交聯(lián)復(fù)合物[5]，熟制的皮張仍含有少量的DNA[6，7]，由于熟制的皮張含的DNA少，提高膠原蛋白的消化效果，把真皮成分膠原纖維徹底消化掉，才能將DNA釋放出來(lái)；在皮張預(yù)處理時(shí)，盡可能減成小塊，使其能夠消化完全.用Promega裂解液能夠很好地將皮張消化完全.

圖2中10號(hào)樣品采集的是林麝腹部較軟的皮子，沒(méi)有能提取到DNA，也沒(méi)有得到擴(kuò)增產(chǎn)物，這可能是由于皮張?jiān)谑熘七^(guò)程中有酸浸和刮削等工藝[8]，酸浸液會(huì)使皮膚中含有的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、毛囊及其附屬腺體的細(xì)胞等細(xì)胞遭到破壞[9]，使DNA溶出，并隨廢液流失；對(duì)皮板刮削會(huì)使處于真皮深層的毛囊遭到破壞，使DNA進(jìn)一步丟失.通過(guò)以上的試驗(yàn)說(shuō)明，熟制標(biāo)本皮張?zhí)崛NA時(shí)，不應(yīng)采集腹部較軟的皮子，應(yīng)采集四肢、指甲縫、表皮褶皺的地方，這些地方受到的酸浸液和刮削的影響比較少，容易保留較多的DNA.

由于陳舊標(biāo)本經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期放置，核DNA 受到紫外線照射和每年定期的防蟲(chóng)熏蒸以及其它環(huán)境因素影響，降解的程度嚴(yán)重，所以在進(jìn)行總DNA電泳測(cè)試時(shí)，沒(méi)有得到明顯條帶.由圖1和圖2可見(jiàn)，雖然DNA降解很厲害，但仍然能特異性地?cái)U(kuò)增出mtDNA上的片段，這是由于mtDNA是環(huán)狀DNA，比核細(xì)胞DNA難降解[10].在DNA提取過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，殘存于皮板中的水溶性重金屬離子、鞣劑等酶抑制劑難以從體系中去除，所以標(biāo)本樣品用Na2HPO4溶液浸泡前處理，去除鉻離子是非常重要的；并在DNA提取最后選擇用DNA提取純化試劑盒(DNA IQTM系統(tǒng)Promega)進(jìn)行二次提取，才能有效的去除大部分的水溶性重金屬離子和PCR抑制劑.

3 結(jié) 論

標(biāo)本樣品用Na2HPO4溶液浸泡前處理，并在DNA提取最后選擇用DNA提取純化試劑盒(DNA IQTM系統(tǒng)Promega)進(jìn)行二次提取，才能有效的去除大部分的水溶性重金屬離子和PCR抑制劑；標(biāo)本林麝核DNA 受到紫外線照射和每年定期的防蟲(chóng)熏蒸以及其它環(huán)境因素影響，降解的程度嚴(yán)重，但仍然能特異性地?cái)U(kuò)增出mtDNA上的片段；熟制林麝標(biāo)本皮張和新鮮肌肉都能提取到純度較高的DNA，紫外吸收值測(cè)DNA濃度的OD值差不多，但擴(kuò)增和電泳結(jié)果表明熟制林麝標(biāo)本皮張DNA含量明顯低于新鮮肌肉.

參考文獻(xiàn)

[1] 陳 璐,岳 曦. 非損傷性取樣研究進(jìn)展[J]. 四川動(dòng)物,2007,26(1):224-226.

[2] 饒 剛,李 明,牛屹東,等. 陳舊皮張中DNA提取的新方法[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志, 2001, 36 (4) : 53-57.

[3] 史 燕,吳孝兵,晏 鵬,等. 揚(yáng)子鱷鞣制皮革和鱗片的DNA提取方法[J]. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2004, 50 (2) : 297-301.

[4] 蘭 宏，王 文，施立明.鹿屬動(dòng)物陳舊皮張標(biāo)本的DNA提取及PCR擴(kuò)增[J].動(dòng)物學(xué)研究，1995，16(2):146-152.

[5] 林 煒，穆暢道.與鉻鞣有關(guān)的膠原化學(xué)研究進(jìn)展[J].化學(xué)進(jìn)展，2000，12(2):2 185-227.

[6] 賈學(xué)淵，白素英，徐艷春，張 偉. 鞣制皮張DNA的提取[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007,35(11):66-69.

[7] Svintradze DV, Mrevlishvili GM. Fiber molecular model of collagen triple helix and DNA double helix complex in aqueous solution[J]. Asian Journal of Biochemistry, 2006, 1 (1) : 18-27.

[8] 張 偉,景松巖,徐艷春. 毛皮學(xué)[M]. 哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社, 2002: 1-7.

[9] Donglas C Wallace. Mitochondrial DNA in aging and disease[J].Scientific American ,1997 ,(8):40-47.

[10] Ramasami T, Raghavan KV. Environment-friendly leather chemicals[J]. The LeatherManufacturer, 1993 (11) : 6-13.