李鴻泓，鞠大宏，滕靜如，李 艷，劉 紅，王少君，潘靜華，于 崢，劉梅潔

左歸丸是滋陰補腎法的代表方劑，出自明代溫補名家張景岳的《景岳全書·新方八陣》，是張景岳由六味地黃丸化裁而來。我們以往的研究表明，其對卵巢切除所致的大鼠骨質疏松癥有一定的治療作用［1-3］。在以往研究工作的基礎上，本研究建立大鼠糖皮質激素性骨質疏松模型，旨在對左歸丸對糖皮質激素性骨質疏松癥的治療作用機理進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物

Wistar雌性大鼠 42只，體重200g～220g，清潔級，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供(實驗動物許可證號 SCXK(軍)2002-001)。大鼠在中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所清潔級實驗動物室內飼養(yǎng)(實驗動物室許可證號SYK11-00-0039)。

1.2 藥物

左歸丸方藥組成:熟地 24g，山藥 12g，枸杞子12g，山萸肉 12g，牛膝 9g，莬絲子 12g，龜板膠 12g，鹿角膠12g。常規(guī)水煎制，含量為9.52g生藥 /kg，給藥濃度為0.952g/ml。地塞米松磷酸鈉注射液:天津金耀氨基酸有限公司生產(批號0704031)，規(guī)格:1ml:5mg，使用時用生理鹽水稀釋至1mg/ml，給藥體積 0.1ml/100g體重，給藥劑量 0.1mg/100g體重。

1.3 試劑

大鼠血清雌二醇(E2)和甲狀旁腺激素(PTH)ELISA試劑盒均購自美國ADL公司。戊巴比妥鈉由北京通縣育才精細化工廠生產(批號950427);鹽酸四環(huán)素由欣惠澤奧科技有限公司提供(批號US22105);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)由北京北化精細化學品有限責任公司生產(批號20060324);甲基丙烯酸甲酯由北京益利精細化學品有限公司生產(批號20050317);甲基丙烯酸丁酯由北京益利精細化學品有限公司生產(批號980716);聚乙二醇400由北京化學試劑公司生產(批號050425);苯甲酸甲酯由華北地區(qū)特種化學試劑開發(fā)中心(天津)生產(批號980923);過氧化苯甲酰由北京金龍化學試劑有限公司生產(批號20000420);N，N－二甲基對甲苯胺(N，N-Dimethylp-toluidine)由ALDRICH公司生產。Lot.:04327MB-235;Ⅰ液:100ml甲基丙烯酸甲酯 +35ml甲基丙烯酸丁酯+5ml苯甲酸甲酯 +1.2ml聚乙二醇400;Ⅱ液:Ⅰ液+0.4g干燥過氧化苯甲酰;Ⅲ液:Ⅱ液 +0.8g干燥過氧化苯甲酰。

1.4 儀器

冷凍切片機:英國 TBS公司;Reicheit-Jung2040切片機:德國;LEICA CTR6000顯微鏡:德國Leica公司;Leica-Qwin圖像分析儀系統(tǒng):德國Leica公司;酶標儀:美國 Thermo公司;洗板機:美國Thermo公司:恒溫恒濕箱:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.5 方法

1.5.1 動物分組及處理 將42只雌性 Wistar大鼠隨機分為3組:空白對照組12只，模型組15只，左歸丸組15只。模型組大鼠肌注地塞米松0.1ml/100g體重，給藥濃度為 1mg/ml，給藥劑量為1mg/kg體重，每周2次，連續(xù)8周;空白對照組則相應肌注等體積的生理鹽水。左歸丸組除按以上方法肌注地塞米松外，還灌胃給予左歸丸水煎劑1ml/100g體重，給藥濃度為 0.952g生藥/ml，給藥劑量為9.52g生藥/kg體重，以上給藥每天 1次，每周6d，連續(xù)8周。

各組大鼠于處死前16d和前3d分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重，以對骨進行熒光標記。給藥結束后，采用大鼠麻醉后股動脈取血法，所取全血靜置1h后，經2000rmp離心10min后取血清，－20℃冰箱保存用于ELISA檢測。然后將各組大鼠迅速處死，取右側脛骨制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態(tài)計量學指標的檢測。

1.5.2 骨組織形態(tài)計量學指標的測定 不脫鈣骨切片的制作及染色:取大鼠右側脛骨近端1/3，4%多聚甲醛溶液固定后用乙醇逐級脫水:80%、95%、100% 乙醇各2d，二甲苯透明2d。標本依次在塑料聚合液Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中各浸泡3d。隨后，將 400μlN，N-二甲基對甲苯胺 (N，N-Dimethyl-ptoluidine)加入到100ml預冷(4℃)Ⅲ液中，在青霉素小瓶中注入約7ml的Ⅲ液，將骨標本按同一方向放入瓶底用塞蓋緊，用注射器抽空包埋瓶中空氣，然后置于－20℃冰箱中聚合1周左右，變?yōu)闊o色透明的堅硬包埋塊。修塊后，每塊個塊切出5μm的縱向不脫鈣骨切片各2張，其中1張甲苯胺藍染色，另1張用于熒光觀察。

骨組織形態(tài)計量方法:采用Leica-Qwin圖像分析儀系統(tǒng)，對不脫鈣骨切片進行形態(tài)計量。骨小梁體積百分比(TBV%):骨小梁體積占被測骨髓腔總體積的百分比，是衡量骨量水平的主要標志;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不規(guī)則﹑凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷破骨細胞的活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨細胞被覆的類骨質表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷成骨細胞的活性。

1.5.3 外周血血清中雌二醇(E2)和甲狀旁腺激素(PTH)含量的檢測 采用ELISA法檢測血清E2和PTH的含量。具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計學分析

實驗結果皆以珋x±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)進行數(shù)據處理，組間兩兩比較，采用 q檢驗。

2 結果

2.1 左歸丸對糖皮質激素所致骨質疏松大鼠骨組織形態(tài)計量學指標的影響

表1顯示，模型組大鼠脛骨TBV%顯著低于空白對照組，而左歸丸組的TBV%則顯著高于模型組，但與空白對照組相比仍有顯著差異。與空白對照組比較，模型組大鼠脛骨 TRS%顯著增高，而TFS%顯著降低。左歸丸組的TRS%與空白對照組相比顯著增高，而TFS%明顯降低;與模型組相比，左歸丸組的 TRS%沒有差異，但有明顯降低趨勢，TFS%則顯著增高。

表1 各組大鼠脛骨TBV%、TRS%及TFS%的變化

2.2 左歸丸對糖皮質激素所致骨質疏松大鼠血清中E2含量的影響

表2顯示，模型組大鼠血清中E2的含量比空白對照組顯著降低。左歸丸組大鼠血清中E2的含量與模型組相比，顯著增高，但較之空白對照組仍顯著降低。

表2 各組大鼠血清中E2的含量

2.3 左歸丸對糖皮質激素所致骨質疏松大鼠血清中PTH含量的影響

表3顯示，模型組大鼠血清中PTH的含量比空白對照組顯著增高。左歸丸組大鼠血清中PTH的含量與模型組相比顯著降低，但較之空白對照組仍明顯增高。

表3 各組大鼠血清中PTH的含量

3 討論

雌激素主要通過對成骨細胞和破骨細胞直接作用，調節(jié)成骨細胞分泌的局部細胞因子，加強降鈣素的分泌，促進維生素D的合成，降低PTH對骨敏感性以及調節(jié)神經遞質等環(huán)節(jié)對骨代謝產生影響?？傊?，雌激素可通過多靶點多環(huán)節(jié)對骨代謝進行調節(jié)，促進骨形成，抑制骨吸收［4］。而PTH對骨的主要作用是促進骨吸收，這主要是對破骨細胞的綜合作用。其對破骨細胞的作用是間接增加破骨細胞中鈣離子的數(shù)量，使破骨細胞數(shù)量增加，活性增強。同時，PTH持續(xù)分泌可以激活大量位于骨內膜中的骨原始細胞，使這些細胞加速分解并形成前破骨細胞和新破骨細胞，最終使破骨細胞的數(shù)量增多、活性增強，促進骨的吸收和溶解，使骨鈣釋放入血，提高血鈣水平。

沈培芝等研究補腎方預防和治療地塞米松致雄性大鼠骨質疏松的療效。研究發(fā)現(xiàn)，預防組和治療組大鼠的全身骨密度、股骨抗彎強度、血清睪酮水平均明顯高于地塞米松組，而血清甲狀旁腺素水平低于地塞米松組。說明應用補腎方可以提高性激素水平并降低血清甲狀旁腺素水平，從而能夠有效地預防治療地塞米松誘導的雄性大鼠骨質疏松［5］。本實驗的研究結果也證明了這一點。骨組織形態(tài)計量學結果顯示，大鼠經連續(xù)大量使用糖皮質激素后，作為骨量主要標志的脛骨TBV%顯著降低，代表骨吸收參數(shù)的 TRS%顯著增高，而代表骨形成參數(shù)的TFS%降低，表明使用糖皮質激素所造成的是一種骨形成降低、骨吸收增加而骨吸收大于骨形成的骨質疏松模型。給大鼠灌服左歸丸后，TBV%顯著增高，TRS%與模型組相比雖無差異，但有明顯的降低趨勢，且TFS%明顯增高。這一結果表明，左歸丸能使糖皮質激素所致骨吸收增高和骨形成降低的骨量丟失狀態(tài)得到控制和逆轉，從而導致骨量的增加。實驗還采用ELISA法檢測了各組大鼠血清中E2和PTH的含量。結果顯示，模型組大鼠血清中 E2的含量比空白對照組顯著降低，而PTH的含量比空白對照組顯著增高。左歸丸組大鼠血清中E2的含量與模型組相比顯著增高，而PTH含量顯著降低。說明左歸丸可以調節(jié)糖皮質激素所致的E2和PTH的紊亂狀態(tài)，使之恢復到基本正常，這是其治療糖皮質激素性骨質疏松癥的作用機理之一。

總之，左歸丸可通過調節(jié)血清中 PTH和E2的水平而達到治療糖皮質激素性骨質疏松的目的，使PTH的水平下調，同時上調E2的水平，使其紊亂狀態(tài)基本恢復正常。當然，左歸丸治療糖皮質激素性骨質疏松癥的機理是非常復雜的，本實驗只是對其中幾個環(huán)節(jié)進行了探討，其機理還有待于進一步的深入研究。

［1］ 劉梅潔，鞠大宏，趙宏艷，等.“腎主骨”的機理研究—左歸丸含藥血清對破骨細胞分化調控因子OPG、RANKL蛋白表達的影響.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2009，15(3):184-187，196.

［2］ 鞠大宏，劉梅潔，趙宏艷，等.左歸丸含藥血清對成骨細胞OPG、RANKL mRNA表達的影響.北京中醫(yī)藥大學學報.

［3］ 鞠大宏，趙宏艷，劉梅潔，等.左歸丸含藥血清對成骨細胞 IL-1、IL-6和COX-2表達的影響.中國實驗動物學報，2006，14(2):96-99.

［4］ 李 恩，等編著.骨質疏松鑒別診斷與治療.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005.

［5］ 沈培芝，陳東煜，張 戈，等.補腎方防治地塞米松致雄性大鼠骨質疏松及其生化機制探討.中國中西醫(yī)結合雜志，1998，18(5):290-292.