王慧睿，李賽美，王保華，熊學(xué)軍，陳 云，林 潔

糖尿病心肌病的病理生理特點(diǎn)為左心室舒張功能障礙，晚期也有收縮功能減低，心肌及間質(zhì)細(xì)胞的重構(gòu)是糖尿病心肌病左心室舒張和收縮功能障礙的主要原因之一，目前臨床尚缺乏有效治療。降糖三黃片是針對(duì)2型糖尿病氣陰不足、瘀血阻絡(luò)的病機(jī)，由《傷寒論》經(jīng)方桃核承氣湯加味研制而成。前期研究已發(fā)現(xiàn)，加味桃核承氣湯對(duì)2型糖尿病及其心血管并發(fā)癥具有一定的防治作用［1-3］。本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察糖尿病心肌病發(fā)生心室重構(gòu)時(shí)的超微結(jié)構(gòu)變化以及中藥降糖三黃片對(duì)其的防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及造模 SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體重50g～80g，購(gòu)自南方醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)所，合格證001號(hào)，環(huán)境設(shè)施合格證028號(hào))。所有大鼠普通飼料(總熱量6.94J/g，其中蛋白質(zhì)23%，碳水化合物53%，脂肪5%(購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，改用高脂飼料(總熱量4.9kcal/g，其中蛋白質(zhì)20%，碳水化合物35%，脂肪45%，蛋氨酸按1%比例添加，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)喂養(yǎng)1個(gè)月。造模前禁食12h，造模組按30mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射STZ(溶于0.1mmol/L檸檬酸緩沖液，pH4.5)，正常組腹腔內(nèi)注射等量檸檬酸緩沖液。1周后，測(cè)定空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和空腹胰島素(Fasting insulin，F(xiàn)INS)，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)［Insulin sensitive index，ISI，ISI=In(FINS ×FBG)－1］。連續(xù)2次空腹血糖≥11.1mmol/L，查尿糖++以上，胰島素敏感指數(shù)降低，且有多飲、多尿、多食現(xiàn)象，確認(rèn)為2型糖尿病模型。2型糖尿病大鼠成模后，給予高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)8周，即出現(xiàn)糖尿病大鼠心肌病變［4］。

1.1.2 試劑及藥品 鏈脲佐菌素購(gòu)自Sigma公司;降糖三黃片為廣州中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑，規(guī)格為每片0.25g;卡托普利片(商品名:開(kāi)博通)為中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格為每片12.5mg。

1.1.3 主要儀器 美國(guó)雅培公司快速微量血糖儀;Acuson sequoia 512高頻超聲診斷儀;Hitachi H-7500透射電子顯微鏡購(gòu)自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組與造模組(含模型組與治療組)。糖尿病造模成功后造模組進(jìn)一步分層，隨機(jī)分為模型組、降糖三黃片干預(yù)組、卡托普利干預(yù)組。49只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，正常組10只，模型組13只，降糖三黃片干預(yù)組13只，卡托普利干預(yù)組13只(余5只或死亡或不符合條件)。中藥組(降糖三黃片)藥量按787.5mg/(kg(d)的劑量給予，西藥組(卡托普利)藥量按照4mg/(kg(d)的劑量給予，正常組及模型組灌服等量蒸餾水。

1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 STZ注射1周后，大鼠禁食12h后空腹眼眶靜脈竇采血。糖尿病大鼠造模成功后8周，處死前腹主動(dòng)脈采血檢測(cè)FBG、膽固醇和甘油三酯以及胰島素。

1.2.3 心功能的超聲檢測(cè)［5］實(shí)驗(yàn)?zāi)┬谐曅膭?dòng)圖檢查。二維超聲檢測(cè)指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑(LVED，mm)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF，%)，組織多普勒指標(biāo)包括左室側(cè)壁二尖瓣環(huán)收縮期最大運(yùn)動(dòng)速度(Sm，cm/s)、舒張?jiān)缙谧畲筮\(yùn)動(dòng)速度(Em，cm/s)、舒張晚期最大運(yùn)動(dòng)速度(Am，cm/s)和舒張?jiān)缙谂c舒張晚期最大運(yùn)動(dòng)速度比值(Em/Am)。

1.2.4 取材及電鏡標(biāo)本制作 經(jīng)心臟超聲檢查后，迅速打開(kāi)胸腔摘取心臟，以冰冷的生理鹽水沖洗去血液，小心剪去連接心臟的血管，用濾紙吸干水迅速以電子天平稱(chēng)全心重量;沿房室交界處剪去心房部分，將余下的室間隔、左室游離壁作為左室重量(Left ventricles weight，LVM)，左室重量與體質(zhì)量的比值分別作為左室重量指數(shù)(LVMI，mg/g)。再將左心室切成1mm3小塊，先用體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛固定，0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)沖洗，再用10g/L鋨酸固定，PBS洗，酒精丙酮系列脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，AO超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，最后置透射電鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以珋x±s表示。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多樣本均數(shù)間比較采用one-wayANOVA檢驗(yàn)，組間比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及生化指標(biāo)比較(見(jiàn)表1)

表1 各組大鼠體質(zhì)量及生化指標(biāo)比較(珋x±s)

表2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較(珋x±s)

2.2 降糖三黃片對(duì)糖尿病心肌病大鼠心功能的影響(見(jiàn)表2)

2.3 降糖三黃片對(duì)糖尿病心肌病大鼠左心室重量指數(shù)的影響(見(jiàn)表3)

表3 各組大鼠心臟重量、左心室重量及左心室重量指數(shù)改變(珋x±s)

2.4 降糖三黃片對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響(圖1)

2.4.1 正常組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 心肌組織由眾多的心肌細(xì)胞組成，心肌細(xì)胞有分枝，細(xì)胞間由閏盤(pán)相連，形態(tài)正常。胞核位于心肌細(xì)胞中央部位，呈長(zhǎng)桿狀，核內(nèi)以常染色質(zhì)為主，少量異染色質(zhì)分布于核膜下或分散存在于核質(zhì)中，兩層核膜清晰可辨;細(xì)胞縱切面可見(jiàn)胞漿充滿(mǎn)大量縱向平行排列的肌原纖維;I帶、A帶、H帶與 Z線、M線均明顯易辨，形成明暗相間的肌節(jié)結(jié)構(gòu);胞漿中有豐富的線粒體，位于核旁與與肌原纖維束間，呈圓形或卵圓形，其嵴密集，排列有序，充滿(mǎn)整個(gè)線粒體內(nèi)腔。

2.4.2 模型組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 心肌細(xì)胞縱切面可見(jiàn)肌原纖維排列紊亂、斷裂、分離、局部溶解;線粒體腫脹，外膜不完整，嵴減少與稀疏，部分線粒體缺失;胞核染色質(zhì)凝聚，核膜不完整并呈節(jié)段性溶解消失病變。

2.4.3 卡托普利組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)也較接近正常，細(xì)胞核長(zhǎng)桿狀，位于細(xì)胞中央，形態(tài)與正常組相似，肌原纖維無(wú)病變，線粒體形態(tài)輕度腫脹，個(gè)別有畸形病變;胞核染色質(zhì)有輕度凝聚現(xiàn)象。

2.4.4 降糖三黃片組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)接近正常組，胞核長(zhǎng)桿狀，位于細(xì)胞中央，形態(tài)正常;肌原纖維排列整齊，與正常組相近;線粒體形態(tài)輕度腫脹，胞核染色質(zhì)有輕度凝聚現(xiàn)象。

3 討論

圖1 糖尿病大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察(放大比例為×8000，標(biāo)尺為1 m)

糖尿病心肌病是一種獨(dú)立的糖尿病并發(fā)癥，其臨床特征以左室舒張功能障礙為主，隨著病程的進(jìn)展也會(huì)出現(xiàn)收縮功能降低，逐漸發(fā)展為充血性心力衰竭［6］。心室重構(gòu)是指心室結(jié)構(gòu)改變，包括心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞的增殖及膠原組織增生等，同時(shí)心臟的功能也受到明顯影響。隨著心肌肥厚以及心室重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展，心律失常、心衰和猝死的發(fā)生率也隨之提高。目前的治療仍局限在以控制血糖為基礎(chǔ)，尚無(wú)特異有效的治療方法。中醫(yī)藥以整體調(diào)節(jié)、毒副作用小在糖尿病心肌病心室重構(gòu)的調(diào)節(jié)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。針對(duì)2型糖尿病氣陰不足、瘀血阻絡(luò)的病機(jī)，我院由《傷寒論》經(jīng)方桃核承氣湯加味研制而成中藥降糖三黃片，具體藥物有北黃芪、大黃、生地、桃仁、玄參、麥門(mén)冬、桂枝、甘草、玄明粉，在臨床運(yùn)用取得良好效果。運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與手段，探討糖尿病心肌病心室重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步提高療效、拓展中藥降糖三黃片在臨床的應(yīng)用范圍具有重要意義。

本研究以高脂高熱量飼料誘導(dǎo)加小劑量鏈脲佐菌素注射建立動(dòng)物模型，具有中度胰島素抵抗、中度高血糖、高血脂等表現(xiàn)，基本符合2型糖尿病的臨床特點(diǎn)。電鏡檢查顯示，大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，肌原纖維呈灶性溶解，線粒體腫脹，外膜不完整，嵴減少與稀疏，胞核染色質(zhì)凝聚，核膜不完整并呈節(jié)段性溶解消失，與以往報(bào)道的糖尿病心肌超微結(jié)構(gòu)改變一致。超聲心動(dòng)圖檢查顯示，在模型組反映左室舒張功能的指標(biāo)Em/Am顯著降低，反映左室收縮功能的指標(biāo)LVEF和Sm顯著降低，提示本研究建立的動(dòng)物模型符合2型糖尿病心肌病。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)┠Ｐ徒M大鼠左室重量、左室重量指數(shù)均顯著增加，說(shuō)明在糖尿病心肌病基礎(chǔ)上出現(xiàn)了心室的重構(gòu)，為今后糖尿病心肌病心室重構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究提供了良好的載體。

研究結(jié)果表明，中藥降糖三黃片不僅能緩解糖尿病大鼠“三多一少”的臨床癥狀，在客觀指標(biāo)上還能夠有效地降低血糖、血脂水平，減輕胰島素抵抗，全面改善2型糖尿病所導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂狀態(tài)，這與既往關(guān)于加味桃核承氣湯改善糖脂代謝紊亂的報(bào)道一致［7、8］。超聲心動(dòng)圖及透視電子顯微鏡觀察中藥降糖三黃片能夠改善心功能各項(xiàng)指標(biāo)，降低左室重量指數(shù)，有效改善糖尿病心肌病大鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)，逆轉(zhuǎn)其心室重構(gòu)的過(guò)程，其效果與西藥卡托普利相似，2組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。推測(cè)其作用機(jī)制如下:①通過(guò)其對(duì)糖尿病的血糖控制，延緩糖尿病心肌病的發(fā)生，改善其預(yù)后;②降糖三黃片中活血通絡(luò)的成分如桃仁、桂枝、大黃等能夠改善心肌的微循環(huán)，從而起到延緩糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的作用;③降糖三黃片的作用效果與卡托普利有相似之處，是否其作用機(jī)制也通過(guò)作用于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶途徑需要進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

［1］ 李賽美，熊曼琪，林安鐘，等.中醫(yī)不同治法對(duì)糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎致心肌缺血預(yù)防作用的對(duì)比觀察［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20(6):438-440.

［2］ 李賽美，熊曼琪，林安鐘，等.不同造模法糖尿病大鼠心肌電鏡觀察及對(duì)中藥效應(yīng)的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6(6):14-16.

［3］ 李賽美，儲(chǔ)全根，莫 偉，等.加味桃核承氣湯及提取物對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)弓病變影響的電鏡觀察［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，22(2):134.

［4］ 李賽美，吳玲霓，儲(chǔ)全根，等.加味桃核承氣湯及其不同提取物對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28(3):236.

［5］ Julius M.Gardin， Francis M Siri， Richard N，et al.Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice Leinwand［J］.American Heart Association，Inc Circulation Research，1995，76:907-914.

［6］ Hayat SA，Patel B，Khattar RS，et al.Diabetic cardiomyopathy:mechanisms，diagnosis and treatment［J］.Clin Sci(Colch)，2004，107(6):539-557.

［7］ 熊曼琪，梁柳文，林安鐘，等.加味桃核承氣湯治療2型糖尿病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1992，12(2):74-76.

［8］ 熊曼琪，林安鐘，朱章志，等.加味桃核承氣湯對(duì)2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，17(3):165-168.