陳 穎，陳英梅，祝維峰，郭潔文，楊 帆

缺血性腦卒中是由于腦血流供應(yīng)障礙引起缺血、缺氧，導(dǎo)致局限性腦組織缺血性壞死或腦軟化的疾病，而腦缺血再灌注損傷是引發(fā)多種腦血管疾病的重要病理生理機制，而有效的治療方法為抗腦缺血再灌注損傷。我國使用中草藥防治腦血管疾病由來已久，但是傳統(tǒng)的中藥口服給藥途徑很大程度上限制了中藥療效的充分發(fā)揮，尤其對中風(fēng)吞咽困難或神志不清者，口服給藥則更為困難。中藥靜脈注射液由于制劑工藝復(fù)雜，有效成分提取難度大，以致其品種和數(shù)量有限，難以滿足臨床需要。而傳統(tǒng)的中醫(yī)鼻藥療法，具有簡便、實用、無創(chuàng)、安全、用藥少、速效、高效的特點。腦清噴鼻微乳的處方是由廣州市中醫(yī)院祝維峰教授積多年臨床經(jīng)驗研制出的治療缺血性中風(fēng)復(fù)方中藥。本文應(yīng)用血清藥理學(xué)方法對腦清噴鼻微乳進行了研究［1］，采用谷氨酸和物理缺氧對PC12細胞進行損傷建立缺氧模型，比較微乳與傳統(tǒng)水提制劑以及鼻腔與灌胃不同給藥途徑得出的血清對損傷細胞的保護作用。

1 材料與儀器

SD大鼠250g～300g，中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(合格證號 SCXK(粵)2008-0020，粵監(jiān)證字2008A002);大鼠的腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12細胞，中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心);DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(Gibco公司);胰酶(Amresco公司);谷氨酸(康龍生物有限公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司);乳酸脫氫酶試劑盒(LDH試劑盒，南京建成生物工程研究所);腦清噴鼻微乳(自制，含生藥 1g/ml);空白微乳(自制，Cremophor EL:乙醇:水=10:10:80);尼莫地平注射液(山東新華制藥股份有限公司，批號0808176);其他試劑均為分析純。

二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeus細胞培養(yǎng)箱);LEICA DFC420倒置顯微鏡(LEICA);M450型ELISA Reader酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 PC12細胞的培養(yǎng)

PC12細胞凍存于液氮中，用時進行復(fù)蘇。培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液，含5%胎牛血清，用NaHCO3調(diào)至p H7.2左右。在37℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長滿培養(yǎng)瓶底后倒掉培養(yǎng)液，用PBS液輕輕蕩洗1～2次，加入0.25%的胰蛋白酶液，消化2min～3 min吸棄消化液，加入 DMEM培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打，使細胞分散開，倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)。然后用DMEM培養(yǎng)液將細胞稀釋為5×105個/ml的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板(100μl/孔)培養(yǎng)，待細胞長滿單層即可用于實驗。

2.2 含藥血清的制備

健康SD大鼠30只，適應(yīng)飼養(yǎng)1周，將動物隨機分成10組。

灌胃給藥組分為腦清噴鼻微乳高、中、低劑量組及水提液組和模型組。腦清噴鼻微乳高、中、低劑量組給藥劑量分別為20、10、5 ml/kg，相當(dāng)于臨床給藥劑量的15、7.5、3.8倍等效劑量;水提液組給藥劑量為20 ml/kg，相當(dāng)于臨床給藥劑量的7.5倍等效劑量;空白微乳對照組給予等體積的空白微乳;模型組給予等體積的生理鹽水。灌胃給藥，每日早晚各1次，間隔12h，連續(xù)給藥3d。

鼻腔給藥組分為腦清噴鼻微乳組，給藥劑量為20ml/kg，相當(dāng)于臨床給藥劑量的40倍等效劑量;水提液組給藥劑量為20ml/kg，相當(dāng)于臨床給藥劑量的40倍等效劑量;空白微乳對照組給予等體積的空白微乳;模型組給予等體積的生理鹽水，8h持續(xù)給藥。以上各組于末次給藥1h后乙醚麻醉，頸動脈取全血，室溫放置1h，離心10min(3000r/min)，小心分離血清，于56℃ 30min滅活，經(jīng)0.22μm濾膜濾過除菌，－20℃保存。

2.3 分組與給藥方法

將對數(shù)生長期的 PC12細胞以1×105/孔密度接種于96孔板，37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)的PC12細胞分別處理:①正常對照組:DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做損傷處理;②谷氨酸損傷模型組:在預(yù)處理的細胞中加入終濃度為20mmol/L的谷氨酸，繼續(xù)培養(yǎng) 24h［2］;③缺氧復(fù)氧損傷組:將預(yù)處理的細胞置密閉玻璃干燥器中，真空泵抽真空(－0.01MPa)，保持抽取30min直至抽完培養(yǎng)基中的溶解氧，然后緩慢充入95%N2及5%CO2混合氣，直至恢復(fù)正常氣壓(干燥器中放置氣囊指示裝置)，置37℃孵育12h取出，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 12h，即缺氧 12h，復(fù)氧 12h［3］;④含藥血清保護組:用2.2項下制備的8組含藥血清，以10%含藥血清預(yù)處理1 h后，分別進行②與③項的損傷處理，陽性對照尼莫地平組與空白微乳組平行進行②與③項的損傷處理，對各組細胞進行指標測定。

2.4 觀察指標

2.4.1 細胞形態(tài)觀察 將經(jīng)過2.3處理的PC12細胞，置倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.4.2 MTT法檢測細胞存活率 將經(jīng)過2.3處理的PC12細胞，每孔加入MTT(5mg/ml)10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清，每孔加入DMSO150μl振蕩10 min，溶解細胞中的藍紫色結(jié)晶物，酶標儀測定490 nm波長處吸光度值(A值)，計算細胞存活率%=(實驗組A值－空白對照組A值)/(對照組A值－空白對照組A值)×100%，重復(fù)實驗3次。采用SPSS17.0 for Windows統(tǒng)計軟件對所得的數(shù)據(jù)進行SNK-q檢驗方法處理。

2.4.3 乳酸脫氫酶(LDH)活性測定 經(jīng)過2.3處理后，收集培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書測定乳酸脫氫酶(LDH)的活性，LDH漏出率按下式計算:LDH漏出率(%)=各組吸光值/模型組吸光值×100%。對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。

3 結(jié)果

3.1 細胞形態(tài)觀察

圖1顯示，正常對照組 PC12細胞呈梭形或多角形，有小的短突起，細胞數(shù)量多。谷氨酸和物理缺氧損傷組細胞數(shù)量顯著減少，大量細胞受損，細胞突起回縮，呈圓形，漂浮細胞較多。含藥血清保護組細胞數(shù)量較多，且隨著給藥濃度的增加，細胞存活率趨高，接近正常對照組，細胞貼壁良好，形態(tài)正常，圓形及漂浮細胞減少，說明含藥血清對PC12細胞的損傷有較好的保護作用。正常對照組、損傷組、含藥血清保護組細胞形態(tài)見圖1。

圖1 顯微鏡下PC12細胞形態(tài)(×100)

3.2 MTT法檢測細胞存活率

表1顯示，腦清噴鼻微乳和傳統(tǒng)水提液的含藥血清對PC12細胞的谷氨酸和物理缺氧損傷模型都有保護作用。其中，灌胃給藥3個劑量組的含藥血清對損傷模型有明顯的保護作用并呈現(xiàn)出劑量依賴性，而灌胃給藥和鼻腔給藥的含藥血清對損傷模型的保護作用相當(dāng);而且無論是灌胃給藥還是鼻腔給藥，結(jié)果均顯示腦清噴鼻微乳的含藥血清比水提液的含藥血清保護效果好(P＜0.05)。

表1 MTT法檢測細胞存活率結(jié)果(珋x±s，n=3)

3.3 LDH的漏出量檢測

表2顯示，腦清噴鼻微乳和傳統(tǒng)水提液的含藥血清都抑制了細胞LDH的釋放，說明對PC12細胞的谷氨酸和物理缺氧損傷模型都有保護作用。其中，灌胃給藥3個劑量的含藥血清對損傷模型有明顯的保護作用并呈現(xiàn)出劑量依賴性，而灌胃給藥和鼻腔給藥的含藥血清對損傷模型的保護作用相當(dāng);無論是灌胃給藥還是鼻腔給藥，結(jié)果都顯示腦清噴鼻微乳的含藥血清比水提液的含藥血清保護效果好。

表2 LDH漏出量檢測結(jié)果(珋x±s，n=3)

4 討論

中藥的研發(fā)主要是尋找藥物的有效成分或有效部位，制備精良的中藥制劑，提高臨床療效和降低毒副作用。血清藥理學(xué)可以對有效藥物或藥物的有效成分進行初步篩選，還可以對藥物的制劑工藝進行比較和篩選等。腦清噴鼻微乳方劑是以麝香、冰片芳香開竅為君，配伍石菖蒲、川芎、三七為臣，以加強麝香、冰片開竅醒神之效，并有行氣活血、化痰息風(fēng)之功。薄荷芳香走竄，載藥上行為佐使，全方合用，量小力專，符合治療缺血性中風(fēng)病理機制與治療要求，經(jīng)過多年臨床應(yīng)用證明其療效可靠。結(jié)合微乳本身固有的特殊結(jié)構(gòu)將其制成的鼻腔給藥制劑，可以增加藥物的溶解度，促進藥物吸收，提高藥物的生物利用度，可為腦部疾病的治療提供新給藥途徑。用含藥血清代替煎劑或粗提物進行體外實驗，克服了將中藥復(fù)方制劑直接用于體外實驗的缺點，通過依照制劑的臨床給藥途徑獲取的含藥血清在體外的藥理效應(yīng)來反映藥物在機體內(nèi)的作用，提高了實驗結(jié)果的可信性，能較客觀和真實地闡明中藥的藥效和作用機理。

有關(guān)缺氧誘導(dǎo)凋亡模型的建立有較多文獻報道。本實驗采用谷氨酸和物理缺氧對PC12細胞進行損傷，建立缺氧模型。谷氨酸可通過多種機制引起神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載，使神經(jīng)細胞內(nèi)鈣失衡，引起神經(jīng)細胞凋亡［4］。神經(jīng)細胞內(nèi)游離鈣增多，可激活蛋白激酶和磷脂酶產(chǎn)生自由基，造成細胞損傷。國外很多報道證明，谷氨酸對PC12細胞的毒性包括氧化毒性［5、6］。另外，物理缺氧模型不改變細胞培養(yǎng)基成分的條件，更能真實模擬體內(nèi)缺氧情況，更好地體現(xiàn)藥物的保護作用。

MTT比色法是測定細胞活力常用的方法，MTT指標能反映細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，缺氧復(fù)氧組MTT值的下降是細胞內(nèi)氧化壓力上升的一種體現(xiàn)，并與出現(xiàn)的細胞死亡相關(guān)。細胞死亡或損傷時LDH釋放至培養(yǎng)上清液中，上清液 LDH水平反映了細胞的損傷程度。PC12細胞缺氧復(fù)氧培養(yǎng)或谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞損傷后，細胞活力明顯下降，細胞損傷程度大;而應(yīng)用含藥血清預(yù)處理可明顯增加細胞活力，細胞損傷程度明顯降低。

本實驗證明，大鼠給予不同劑量腦清噴鼻微乳所得的含藥血清對缺氧復(fù)氧損傷模型有明顯的保護作用并呈現(xiàn)出劑量依賴性，而微乳制劑比傳統(tǒng)水提制劑的藥效更好。MTT數(shù)據(jù)顯示，灌胃3.8倍給藥組保護作用最強，陽性對照尼莫地平組其次，微乳鼻腔給藥組僅次于前二者。LDH數(shù)據(jù)顯示，微乳鼻腔給藥組與灌胃3.8倍給藥組結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。實驗結(jié)果進一步證實，腦清噴鼻微乳可經(jīng)鼻黏膜吸收入血而發(fā)揮治療作用，而且可避開首過效應(yīng)，直接到達病灶發(fā)揮作用，為開發(fā)療效好、不良反應(yīng)少的缺血性腦中風(fēng)天然藥物新制劑奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Hiriko Iwama，Sakae Amagaya，Yukio Ogihara，et al.Effect of Shassaikoto.A Japanese and Chinese herbal medical mixture，on the mitogenic activing of lipopolysaccharide-a new pharmacological testing method.J Ethnopharmacol，1987，211:45.

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