賈 園,沈 陽,邱亞峰,史子學(xué),邵東華,王曉杜,鄧緒芳,王皓婷,趙福廣

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林長春130061;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海200241)

2009年春,墨西哥、美國等國家相繼暴發(fā)甲型H1N1流感,并迅速蔓延至世界各地,形成流感大流行。甲型H1N1流感病毒是由豬、禽、人源流感病毒發(fā)生重配產(chǎn)生的新毒株,是一種新型流感病毒[1]。自1918年西班牙大流感暴發(fā)以來,H1N1亞型毒株引起的流感已有近百年的歷史[2]。面對新型流感的大流行,目前主要的檢測方法是分子生物學(xué)檢測方法[3-5]。傳統(tǒng)的RT-PCR其敏感性較差,很難無法區(qū)分季節(jié)性流感與甲型H1N1流感[6]。作為流行病學(xué)研究和疾病監(jiān)測的重要手段,免疫學(xué)檢測技術(shù)不可或缺。

甲型H1N1流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬,是單股負鏈RNA病毒,基因組由8個RNA片段組成,共編碼至少11種蛋白,其中血凝素(Hemagglutinin,HA)是最重要的表面抗原之一。HA的主要功能是與宿主細胞上的唾液酸受體結(jié)合,使病毒黏附于細胞,輔助病毒穿膜內(nèi)吞[7]。人和禽源的流感病毒HA識別的唾液酸受體不同,這也是決定病毒跨種間傳播的機制之一。HA還是流感病毒主要的毒力因子之一[8],是病毒的中和抗原。為了逃逸抗體的識別,HA經(jīng)常發(fā)生變異,建立快速有效的檢測流感病毒的方法是流感防控研究重點之一。

本研究通過pET表達系統(tǒng)在大腸埃希菌BL21(DE3)中表達甲型H 1N1流感病毒截短的HA蛋白,選擇性地表達其胞外區(qū),去掉其信號肽、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)。重組蛋白經(jīng)Ni-NTA His Bind resin純化后,獲得了較純的His融合蛋白,為甲型H1N1流感診斷技術(shù)的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)GenBank發(fā)表的A/California/04/2009(H1N1)HA基因序列合成HA基因并克隆質(zhì)粒中(pUC57-HA)。大腸埃希菌BL21(DE3)、pET-28(a)表達質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室保存。DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生物,DNA膠回收試劑盒和少量DNA片段回收試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)公司。Ni-NTA His Bind resin購自Novagen公司。Influenza A H1N1(Swine Flu 2009)Hemagglutinin Antibody購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司。His抗體購自上海中科英沐生物技術(shù)有限公司,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank發(fā)表的A/California/04/2009(H1N1)HA基因序列,以去掉HA的信號肽、跨膜域和胞漿域的基因序列為模板,用Primer 5.0軟件設(shè)計含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點的上、下游引物:

下劃線序列為酶切位點。引物由上海invitrogen公司合成。

1.2.2 重組pET-28(a)-HA質(zhì)粒的構(gòu)建 以pUC57-HA為模板,PCR擴增,膠回收PCR產(chǎn)物和pET-28(a)質(zhì)粒分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切消化,酶切產(chǎn)物用小片段DNA純化回收試劑盒純化。HA基因和pET-28(a)質(zhì)粒在T4 DNA ligase的作用下,16℃連接過夜。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌BL21,然后挑取單菌落克隆,進行酶切鑒定,并測序確認。

1.2.3 HA蛋白的誘導(dǎo)表達 取鑒定正確的陽性克隆按1∶100的比例轉(zhuǎn)接,37℃搖菌3 h,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,分別于1、2、3、4、5、6 h取樣,確定最佳誘導(dǎo)時間。在最佳誘導(dǎo)條件下大量誘導(dǎo)表達,收集菌體沉淀。10 mL細菌裂解緩沖液重懸,冰浴間歇超聲破菌后離心,分別收集沉淀和上清液,取少量樣品制樣,經(jīng)120 mL/L SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色,分析重組蛋白的表達形式。

1.2.4 重組蛋白的純化 按照上述方法進行大量誘導(dǎo)表達重組蛋白,按照Ni-NTA His°Bind Resins產(chǎn)品使用說明純化蛋白。SDS-PAGE觀察純化效果。純化后的蛋白用碳酸鹽緩沖液梯度透析復(fù)性。

1.2.5 Western blot檢測重組蛋白的表達 重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后,在65 V電壓下轉(zhuǎn)膜2 h,封閉液室溫封閉NC膜2 h,一抗(Influenza A/H1N1/2009病毒HA特異性抗體)孵育4℃過夜,TBST洗滌3次后,二抗孵育室溫作用2 h,TBST洗滌3次后,加入顯色底物顯色,觀察重組蛋白的免疫反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆

HA基因全長1 701 bp,用特異性引物進行PCR擴增HA的部分片段52 bp～1 587 bp,除掉HA的信號肽、跨膜域和胞漿域)大小為1 536 bp,經(jīng)1 0g/L瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1),在約1 500 bp處可見特異性條帶,大小與預(yù)期一致。

圖1 HA基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR products of HA gene

2.2 重組表達質(zhì)粒的鑒定

提取pET-28(a)-HA質(zhì)粒后,經(jīng)EcoR和XhoⅠ酶切消化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2)HA基因被成功亞克隆到pET-28(a)上,同時送該陽性質(zhì)粒到生物公司進行測序驗證,結(jié)果表明和NCBI公布的序列100%一致。

圖2 pET-28(a)-HA重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28(a)-HA with enzy me digestion

2.3 表達產(chǎn)物的鑒定

選擇不同誘導(dǎo)時間觀察HA蛋白的表達情況。誘導(dǎo)1 h～6 h后,經(jīng)120 mL/L SDS-PAGE電泳分析,HA蛋白獲得大量表達。軟件預(yù)測表明去掉信號肽、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的HA蛋白大小為56 ku,如果加上標(biāo)簽蛋白,其大小約60 ku,我們的結(jié)果與理論值一致(圖3)。

圖3 HA重組蛋白的誘導(dǎo)表達Fig.3 Induced expression of HA recombinant protein by IPTG

2.4 HA蛋白的純化

經(jīng)超聲破碎后取樣,SDS-PAGE電泳分析表明,在上清與包涵體中均有表達,但包涵體中表達量更高,所以我們對包涵體通過Ni-NTA His Bind純化,SDS-PAGE電泳分析表明(圖4),我們獲得了較高純度的HA蛋白。

圖4 HA重組蛋白的純化Fig.4 The purification of HA protein

2.5 Western blot檢測重組蛋白的表達

分別以Influenza A/H1N1/2009病毒HA特異性單抗和Anti-His的鼠單抗作為一抗,以H RP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗,進行Western blot檢測,結(jié)果如圖5,兩個單抗均能與約60 ku大小的條帶反應(yīng),表明重組蛋白能被Influenza A/H1N1/2009病毒HA特異性單抗所識別,具有良好的抗原反應(yīng)原性。

圖5 Western blot分析重組蛋白HA的抗原反應(yīng)原性Fig.5 Western blot analysis of the antigenic reactivity of recombinant HA

3 討論

2009甲型H1N1流感大流行波及全世界幾十個國家或地區(qū),在全世界范圍內(nèi)引起了巨大的恐慌,世界衛(wèi)生組織2010年8月宣布甲型流感大流行結(jié)束。2011年1月6日,據(jù)英國衛(wèi)生防護局最新報道,英國自入冬以來已有50人死于流感,其中45人死于甲型H1N1(2009)流感病毒,5人死于乙型流感。建立甲型H1N1的血清學(xué)診斷技術(shù),對于流感病毒的監(jiān)測和檢測起到非常重要的作用。

甲型流感病毒HA蛋白由RNA片段4編碼,基因序列長度為1 742 bp～1 778 bp[9],編碼562～566個氨基酸殘基的蛋白,大小約為75 ku,它是一個被廣泛修飾的糖蛋白。HA蛋白含有4個結(jié)構(gòu)域:信號肽(前導(dǎo)序列)、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),本研究以A/California/04/2009(H1N1)的HA序列為模板,去掉HA的信號肽、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),僅擴增只有1 536 bp大小的HA部分片段,編碼512個氨基酸殘基,預(yù)測蛋白大小約為57 ku。我們選擇性地表達HA的胞外區(qū)蛋白,包括HA1和HA2兩部分,二者以二硫鍵相連[10]。HA1是病毒主要的抗原決定區(qū)和受體結(jié)合位點,HA2與病毒囊膜與宿主細胞膜的融合有很大的關(guān)聯(lián),HA作為主要誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的抗原,在機體免疫反應(yīng)中起重要的作用,所以我們選擇該區(qū)段進行表達,為檢測流感病毒抗體提供抗原。

本試驗成功的構(gòu)建了pET-28(a)-HA表達質(zhì)粒,并通過大腸埃希菌BL21(DE3)成功表達了重組的HA蛋白,經(jīng)Ni-NTA His Bind親和層析純化后,得到較高純度的HA蛋白。Western blot結(jié)果顯示,表達的重組蛋白與Influenza A/H1N1/2009病毒HA特異性單抗有良好的免疫反應(yīng)性。因此,本研究制備的HA蛋白作為抗原,可以作為亞單位疫苗的候選,也為進行甲型H1N1診斷技術(shù)的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

[1] Center for Disease Control and Prevention.Update:infections with a swine-origin influenza A(H1N1)virus-United States and other countries,April 28,2009,MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2009,58:431-3.

[2] World Health Organization,http://www.who.int/csr/don/2009_04_24/en/index.html

[3] Xiaocong Y,Tshidi T,Patricia A M,et al.Neutralizing antibodies derived from the B cells of 1918 influenza pandemic survivors[J].Nature,2008,455,532-536.

[4] 劉 明,趙海波,田永強.2009甲型H1N1流感病毒研究進展[J].生物技術(shù)通報,2010(7):41-43.

[5] 畢保良,李進濤.豬流感診斷技術(shù)研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36(10):179-183.

[6] 王方昆,王一成,袁秀芳.豬流感診斷方法研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2006,27(4):17-21

[7] Vasoo S,Stevens J,Singh K.Rapid antigen tests for diagnosis of pandemic(swine)influenza A/H1N1[J].Clin Infect Dis,2009,49:1090-1093.

[8] Hughson F.Structural characterization of viral fusion proteins[J].Curr Biol,1995,5(3):265-274.

[9] Deshpande K L,Fried V A,Ando M,et al.Glycosylation affects cleavage of an H5N2 influenza virus hemagglutinin and regulates virulence[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1987,84(1):36-40.

[10] 駱建才,劉義志,尚輝琴.豬流感病毒H1N1廣東分離株HA基因的克隆與進化分析[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2010,31(10):14-18.

[11] 余 華.豬流感病毒分子生物學(xué)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2010,31(S):208-212.