何 磊，于鳳波，王永峰，杭太俊

(1.中國藥科大學(xué)，南京 210009； 2.天津天士力研究院，天津 300410)

1 粒細(xì)胞集落刺激因子概述

粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factors, G-CSF)是存在于正常人體、刺激骨髓細(xì)胞集落形成的集落刺激因子的一種，能夠在體內(nèi)外特異地作用于中性粒細(xì)胞系,促進(jìn)其增殖、分化,并能維持功能和存活的一種糖蛋白類生長因子[1]。

早在1986年,由Nagata等從人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系CHU-II中分離了hG-CSF基因,首次確定了其核苷酸序列并在COS細(xì)胞中表達(dá)。hG-CSF是一種單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的由174個氨基酸殘基組成的含30種信號肽的糖蛋白,分子量為19. 6 kDa，PI為6.1，O-糖基化對酸堿(pH 2～10)、熱以及變性劑等相對較穩(wěn)定。hG-CSF有5個半胱氨酸殘基,其中4個半胱氨酸殘基在Cys 36與Cys 42, Cys 74與Cys 64之間形成兩對二硫鍵;Cys 17為不配對半胱氨酸,二硫鍵對于維持G-CSF生物學(xué)功能是必須的因素[2]。

2 粒細(xì)胞集落刺激因子臨床應(yīng)用

G-CSF在臨床上應(yīng)用十分廣泛，骨髓移植時可促進(jìn)中性白細(xì)胞的恢復(fù)；改善再生障礙性貧血伴隨的中性白細(xì)胞缺乏癥；明顯改善癌癥化療時引起的嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞缺乏,加大腫瘤治療的力度,增強(qiáng)治療效果；廣泛應(yīng)用于其他伴有中性粒細(xì)胞減少的疾病及抗感染等的治療。G-CSF天然產(chǎn)物來源非常有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床上的需要。而基因工程的重組G-CSF的生物學(xué)活性與天然的相似，且可大規(guī)模生產(chǎn),利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)可供臨床應(yīng)用的人重組G-CSF的方法已被廣泛應(yīng)用[3，4]。

3 粒細(xì)胞集落刺激因子在大腸桿菌中的表達(dá)研究

早在1985年,Welte K成功地從人膀胱癌細(xì)胞株5637的培養(yǎng)上清液中純化并精制出hG-CSF,然后Welte K與美國的AMGEN公司的Souza L M又進(jìn)一步確定這種hG-CSF的N段氨基酸排列順序,將來源于5637細(xì)胞株的hG-CSF基因克隆化,采用基因工程技術(shù)將該基因插入大腸桿菌成功地制得hG-CSF而開發(fā)出重組人粒細(xì)胞集落刺激rhG-CSF,商品名為Filgratin(惠爾血)。該藥1991年美國FDA批準(zhǔn)上市[5]。

我國科研工作者也成功構(gòu)建多個重組G-CSF工程菌種,利用原核表達(dá)體系實(shí)現(xiàn)高表達(dá)。葛永紅等[6]采用RT-PCR技術(shù)從LPS誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞中擴(kuò)增出人粒細(xì)胞集落刺激因子cDNA,將編碼成熟序列的cDNA在保證編碼氨基酸不變前提下突變并插入到PR啟動子下游,使rhG-CSF在大腸桿菌中獲得表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物為包涵體,占菌體總蛋白量的21.4%。2008年,傅一鳴等采用PCR方法,成功構(gòu)建了C末端融合有一種能特異結(jié)合人抗體Fc段的小肽的新型rhG-CSF融合蛋白(rhG-CSF-tag1)表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的高效表達(dá)、復(fù)性和純化。亦有人采用優(yōu)化密碼子的方法成功實(shí)現(xiàn)了高表達(dá),以及進(jìn)行修飾cDNA 序列后提高表達(dá)的成功先例[7-8]。目前已有長效PEG化的rhG-CSF成功的報道。張兵等[9]經(jīng)大腸桿菌溫度誘導(dǎo)表達(dá)得到包涵體,經(jīng)過變性、復(fù)性和分離純化等步驟處理后得到純化的rhG-CSF。用單甲氧基聚乙二醇活性酯(mPEG20k-NHS)對rhG-CSF進(jìn)行化學(xué)修飾,盡管修飾后的rhG-CSF體外生物學(xué)活性下降至修飾前的20%左右,但其在體內(nèi)的作用時間能夠得到顯著的延長,藥效有了明顯提高。

從制備工藝和G-CSF的構(gòu)效關(guān)系角度考慮,采用原核表達(dá)體系(主要是大腸桿菌表達(dá)體系)具有遺傳背景清楚、細(xì)胞生長迅速、發(fā)酵周期短、易于篩選和基因重組操作、表達(dá)系統(tǒng)較為豐富等優(yōu)點(diǎn)。但是原核表達(dá)體系也存在一些缺點(diǎn)，如外源蛋白無法糖基化和易于形成包涵體等。G-CSF具有糖基化與否并不影響其活性的特點(diǎn),而外源蛋白形成的包涵體必須經(jīng)過變性、再折疊復(fù)性,才能得到活性蛋白產(chǎn)物。但上述表達(dá)G-CSF方法都形成包涵體,必然存在操作過程煩瑣、復(fù)性效率低等問題。原核表達(dá)體系如能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白的胞內(nèi)可溶表達(dá)或周質(zhì)腔分泌表達(dá),在實(shí)踐應(yīng)用中將會大大提高工作效率,節(jié)約生產(chǎn)成本[10]。

人們曾采取多種方式促進(jìn)外源蛋白的可溶表達(dá)。與葡萄球菌蛋白A (SPA)[11]、谷胱甘肽(GST)[12]或硫氧環(huán)蛋白(thioredoxin)[13]融合表達(dá),對部分外源蛋白能夠起到促可溶作用；利用蛋白質(zhì)二硫鍵形成相關(guān)蛋白[14,15]、脯氨酰順反異構(gòu)酶[16]和其他分子伴侶的輔助折疊作用,設(shè)計表達(dá)載體,能夠明顯促進(jìn)外源蛋白的胞內(nèi)可溶表達(dá)。但是,胞內(nèi)可溶表達(dá)方式也具有比較明顯的缺點(diǎn)，如胞內(nèi)屬還原性環(huán)境,不利于外源蛋白形成正確的二硫鍵橋,進(jìn)而影響正確構(gòu)像的形成[17]；需要超聲破碎或壓力破碎細(xì)胞壁才能釋放胞內(nèi)可溶表達(dá)組分,不利于大規(guī)模培養(yǎng)和純化。

比較而言,因?yàn)橹苜|(zhì)腔屬氧化型環(huán)境[17], 可以模擬真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境,有利于形成正確的二硫鍵橋,獲得具有完全生物學(xué)活性的重組蛋白，而且提取周質(zhì)腔表達(dá)組分時不需要破碎細(xì)胞壁,能夠大幅度降低純化成本,所以周質(zhì)腔分泌型表達(dá)是一種理想的表達(dá)方式[17]。

通常將外源蛋白與適當(dāng)?shù)男盘栯娜诤?借助信號肽的引導(dǎo)作用將外源蛋白分泌到周質(zhì)腔中。在所有分泌到大腸桿菌周質(zhì)中的蛋白質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)了信號序列,信號序列對于在大腸桿菌中分泌蛋白質(zhì)是必要的。利用大腸桿菌系統(tǒng),在外源基因的N端融合一段細(xì)菌蛋白的疏水信號肽(OmpA、OmpF、PeIB、PhoA、SpA等，就其本身或有稍微的修飾),可將目的蛋白運(yùn)送到周質(zhì)空間(translocation)。蛋白跨內(nèi)膜后由細(xì)菌的信號肽酶將信號肽切除,獲得具有天然一級結(jié)構(gòu)(不含N端多余的甲硫氨酸)的產(chǎn)物?？刂票磉_(dá)載體的拷貝數(shù),選擇合適的啟動子和培養(yǎng)基,采用適當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)方式和培養(yǎng)條件(培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時機(jī)和誘導(dǎo)時間),會改善周質(zhì)腔分泌型表達(dá)的效率[18]。Perez-Perez等[19]嘗試得到分泌形式的hG-CSF,使用大腸桿菌信號序列之一的OmpA,沒有成功。但為了解決該問題,他們使用兩種分子侶伴蛋白DnaK和DnaJ的共表達(dá)系統(tǒng),僅僅得到少量分泌的hG-CSF。另外,Chung等[20]用另一種信號序列Pe1B試圖得到分泌形式的hG-CSF,同樣沒有成功,但hG-CSF以不溶性包涵體的形式在胞質(zhì)中積累。王富強(qiáng)等[21]構(gòu)建了含有金黃色葡萄球菌蛋白A的信號肽序列的hG-CSF基因,導(dǎo)入到大腸桿菌融合分泌表達(dá)載體pSEGF中,將hG-CSF融合蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中。雖表達(dá)產(chǎn)物具有很好的可溶性,不會聚集形成包涵體,但和胞內(nèi)表達(dá)相比,表達(dá)量較低仍然是該技術(shù)的問題。1998年,金磊[22]在構(gòu)建重組質(zhì)粒時加入信號肽和Trp啟動子,導(dǎo)入大腸桿菌K12菌種中,控制發(fā)酵溫度,得到分泌蛋白,收率達(dá)35%左右。

大腸桿菌分泌蛋白二硫鍵的形成是一系列蛋白協(xié)同作用的結(jié)果,主要是Dsb家族蛋白,迄今為止共發(fā)現(xiàn)了DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DsbE和DsbG。在體內(nèi),DsbA負(fù)責(zé)氧化兩個巰基形成二硫鍵,DsbC和DsbG則負(fù)責(zé)校正DsbA導(dǎo)入的異常二硫鍵。除了直接和二硫鍵的形成相關(guān)外,DsbA、DsbC和DsbG都有分子伴侶功能。該分子伴侶功能獨(dú)立于二硫鍵形成酶的活性并且對二硫鍵形成酶活性具有明顯的促進(jìn)作用。

Carlos等[23]運(yùn)用λPL啟動子,在其他實(shí)驗(yàn)條件，如培養(yǎng)基的組成、誘導(dǎo)時機(jī)、表達(dá)條件、宿主細(xì)胞(大腸桿菌W3110或RB791)等相同的情況下, 利用DsbA、npr、STII，以及一種從天然生長激素中提取的信號蛋白序列(作為對照)等4種不同的信號肽,將目的蛋白分泌到大腸桿菌周質(zhì)腔，通過研究發(fā)現(xiàn),以DsbA作為信號肽序列的重組hGH基因在大腸桿菌W3110或RB791周質(zhì)腔中得到了最高的表達(dá)量,分泌表達(dá)蛋白占總蛋白的80%。利用DsbA蛋白作為信號肽,在實(shí)現(xiàn)G-CSF突變體周間腔水平的分泌表達(dá),得到活性蛋白的生產(chǎn)工藝將會得到長足的發(fā)展。

1 Nafar M,Parvin M,Sadeghi P,etal.Effects of stem cells and granulocyte colony stimulating factor in reperfusion injury.Iran J Kidney Dis,2010,4(3):207

2 Hill C P,Osslund T D,Eisenberg D.The structure of granulocyte-colony-stimulating factor and its relationship to other growth factors.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(11):5167

3 張學(xué)軍,孔南遷.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子在惡性腫瘤化療后應(yīng)用的療效觀察.中國藥房,2010,21(8):713

4 龍女,張巧花,侯淑玲.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀. 中國藥物與臨床,2010,10(6):676

5 于景敏,孟志云,竇桂芳.粒細(xì)胞集落刺激因子的研究新進(jìn)展. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2008,16(2):452

6 葛永紅,儲淳,劉國榮,等.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)在大腸桿菌中的表達(dá)及鑒定.中國生物制品學(xué)雜志,1998,11(2):68

7 烏垠, 楊紅,陸軍,等. 重組人粒細(xì)胞集落刺激因子在Escherichia coli中的表達(dá)研究.東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版),2000,32(04):46

8 Bo-Hye Nam,Geun-Hee An,Gun-Wook Baeck,etal.Molecular cloning and expression of cDNAs for two distinct granulocyte colony stimulating factor genes from black rockfish Sebastes schlegelii.Fish & Shellfish Immunology,2009,27(2):360

9 張兵,鄒文藝,戎隆富,等. 重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的表達(dá)、純化以及PEG修飾. 生物學(xué)雜志,2008,25(2):36

10 羅惠霞,李敏,王玉炯.Reteplase(K)原核分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及其初步表達(dá).生物學(xué)雜志,2010,27(5):7

11 李愛華,唐濤,張惠媛,等.細(xì)菌磁小體的修飾及其在病原物檢測中的應(yīng)用.生物物理學(xué)報,2010,26(8):680

12 蔡學(xué)敏,趙娜,左大明,等.人MASP1 N端片段原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá). 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2008,24(6):546

13 汪洋,馬明浩,馮震,等.重組人谷氨酸脫羧酶65的表達(dá)及活性研究.中國生物工程雜志,2009,29(4):12

14 Yoichi Kurokawa,Hideki Yanagi, Takashi Yura,etal.Overexpression of protein disulfide isomerase DsbC stabilizes multiple-disulfide-bonded recombinant protein produced and transported to the periplasm in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol,2000,66(9):3960

15 Zhang Z,Huang H L.Escherichia coli disulfide-forming related proteins:structures,functions and their application in gene engineering for expressing heterologous proteins in Escherichia coli.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2002,18(3):261

16 彭金彪,韓宏曉,洪 煬,等.日本血吸蟲 Sj CyclophilinA 基因的克隆、表達(dá)及其生物學(xué)功能研究.中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(7):1531

17 王驪麗,耿信篤.源于大腸桿菌蛋白的表達(dá)、液相色譜復(fù)性與純化新進(jìn)展.中國科學(xué),2009,39(8):711

18 Mergulhao F J,Monteiro G A,Larsson G,etal.Evaluation of inducible promoters on the secretion of a ZZ-proinsulin fusion protein in Escherichia coli.Biotechnol Appl Biochem,2003,38(1):87

19 Perez-Perez J,Martinez-Caja C,Barbero J L,etal.DnaK/DnaJ supplementation improves the periplasmic production of human granulocyte-colony stimulating factor in Escherichia coli.Biochem Biophys Res Commun,1995,210(2):524

20 Bong Hyun Chung,Mi-Jin Sohn,Su-Wan Oh,etal.Overproduction of human granulocyte-colony stimulating factor fused to the pelB signal peptide in Escherichia coli.Journal of Fermentation and Bioengineering, 1998,85(4):443

21 王富強(qiáng),周興軍,王彥芳,等.hG-CSF大腸桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建.Pharmaceutical Biotechnology,2001,8(5):260

22 金磊.粒細(xì)胞集落刺激因子的制備.中國專利: 98103011.4,1999-02-03

23 Carlos R J Soares,Fernanda I C Gomide,Eric K M Ueda,etal.Periplasmic expression of human growth hormone via plasmid vectors containing the λPLpromoter: use of HPLC for product quantification.Protein Engineering Design & Selection,2003,16(12):1131