丁小邦 王 健 曹誼林

GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞皮下注射后轉(zhuǎn)歸的實(shí)驗(yàn)研究

丁小邦 王 健 曹誼林

目的 研究綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠（C57BL/6-gfp小鼠）皮膚成纖維細(xì)胞皮下注射后的轉(zhuǎn)歸。方法 以GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，培養(yǎng)收集第3代皮膚成纖維細(xì)胞，按細(xì)胞濃度20×106cells/mL注射到裸鼠頭皮下，分別于細(xì)胞注射后1周、2周、3周、6周及12周，通過(guò)活體熒光檢測(cè)儀、組織學(xué)觀察、冰凍切片熒光顯微鏡觀察及GFP蛋白的免疫組化來(lái)研究注射部位成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。結(jié)果 GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞皮下局部注射后2周內(nèi)明顯存在，3周后注射部位成纖維細(xì)胞明顯減少，并隨時(shí)間推移逐漸減少，12周后僅有少量細(xì)胞存活。結(jié)論 單純注射成纖維細(xì)胞并依賴(lài)其存活以達(dá)到除皺的效果是非常有限。

綠色熒光蛋白 皮膚成纖維細(xì)胞 皮下注射 轉(zhuǎn)歸

臨床上尚沒(méi)有一種效果良好且持久、方法簡(jiǎn)便易于被患者接受的除皺方式。自應(yīng)用于面部除皺的可注射牛膠原出現(xiàn)后，注射除皺越來(lái)越被人們所青睞。目前，國(guó)內(nèi)外常用的注射除皺物包括：①肉毒素；②醫(yī)用膠原和透明質(zhì)酸等；③化學(xué)合成的顆粒充填劑，如PMMA（主要成份為Atecoll）等；④自體成纖維細(xì)胞注射（如Isolagen）。

自體成纖維細(xì)胞注射除皺技術(shù)是從皮膚中分離出皮膚成纖維細(xì)胞，再通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增，收集后回注到自體，2個(gè)月內(nèi)進(jìn)行3次注射。自體培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞（Isolagen）是單純細(xì)胞技術(shù)在注射除皺方面的應(yīng)用[1]，Watson等[2]對(duì)10例因皺紋、痤瘡后瘢痕的病例分兩組進(jìn)行觀察，結(jié)果表明單純注射Isolagen組效果可持續(xù)12個(gè)月，而注射＋激光組效果更佳，且光鏡顯示術(shù)后真皮層膠原厚度和密度增加。

目前認(rèn)為，自體成纖維細(xì)胞注射除皺技術(shù)的作用機(jī)制可能是多次創(chuàng)傷刺激組織增生，也可能是成活的皮膚成纖維細(xì)胞促進(jìn)生長(zhǎng)及膠原分泌。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，自體成纖維細(xì)胞注射除皺技術(shù)對(duì)細(xì)淺皺紋有一定效果，對(duì)稍深的皺紋則無(wú)效，其原因可能與單純成纖維細(xì)胞注射后細(xì)胞成活少，且細(xì)胞不易固定等因素有關(guān)。因此，有效研究成纖維細(xì)胞皮下注射后的轉(zhuǎn)歸情況，是值得探索的課題。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠（C57BL/6-gfp小鼠，以下簡(jiǎn)稱(chēng)GFP小鼠），雌雄不限，體質(zhì)量230 g以上，由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供。

裸鼠，雌雄不限，體質(zhì)量230 g以上，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院動(dòng)物室提供。

1.2 方法

1.2.1 GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的分離

將GFP小鼠皮膚剪至2 mm×2 mm×2 mm大小，PBS振洗1遍；加入0．1%中性蛋白酶4℃消化過(guò)夜，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液清洗、終止消化，并揭去表皮層。余下的真皮組織以0．1%Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫振蕩消化，分3個(gè)階段收獲成纖維細(xì)胞（間隔分別為2 h，4 h，8 h）。消化產(chǎn)物以150目尼龍篩過(guò)濾，細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS振蕩混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清。取少量細(xì)胞懸液用4%乙酸等體積稀釋破壞紅細(xì)胞，加入臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)進(jìn)行拒染試驗(yàn)，證實(shí)活細(xì)胞占總數(shù)的85%以上，用血球記數(shù)板對(duì)活細(xì)胞量進(jìn)行計(jì)數(shù)后，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 GFP小鼠成纖維細(xì)胞接種、培養(yǎng)、觀察和擴(kuò)增

將最終獲得的成纖維細(xì)胞置DMEM培養(yǎng)液（10%FCS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）中混勻，以1×104cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，37℃恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2）內(nèi)培養(yǎng)，每3天換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)至85%融合后傳代。

1.2.3 GFP小鼠成纖維細(xì)胞收集

收集第3代細(xì)胞作為種子細(xì)胞。PBS稀釋至20×106cells/mL,以備注射用。

1.2.4 動(dòng)物分組

共16只裸鼠。其中1只設(shè)為對(duì)照，另15只裸鼠隨機(jī)分為5組，每組3只，分別于細(xì)胞注射后1周、2周、3周、6周及12周進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 動(dòng)物麻醉

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均以10%水合氯醛0．3～0．35 mL/Kg腹腔注射進(jìn)行麻醉。

1.2.6 GFP小鼠成纖維細(xì)胞裸鼠皮下注射

因裸鼠身體皮膚太薄，皮下過(guò)于疏松，故本實(shí)驗(yàn)選擇裸鼠頭皮部注射，用1 mL注射器抽取細(xì)胞液，30G BD注射針頭注射，每個(gè)注射點(diǎn)注射0．15 mL，細(xì)胞盡量注射到頭皮與顱骨之間全層（圖1)，共注射15只裸鼠。

1.3 檢測(cè)

1.3.1 活體動(dòng)物可見(jiàn)光成像儀定性及定量檢測(cè)

分別于細(xì)胞注射后1周、2周、3周、6周及12周，將各組裸鼠麻醉后，對(duì)每只裸鼠頭部進(jìn)行活體熒光掃描（激發(fā)光波長(zhǎng)530 nm），檢測(cè)GFP小鼠成纖維細(xì)胞注射后在體內(nèi)的分布情況，并采集熒光成像圖，以未予任何細(xì)胞注射的裸鼠頭部作空白對(duì)照。通過(guò)尼康NIS-Elements BR 3．0圖像分析處理軟件，計(jì)算熒光信號(hào)強(qiáng)度值，并定量分析熒光信號(hào)分布趨勢(shì)，繪制柱狀圖。

1.3.2 取材

分別于細(xì)胞注射后1周、2周、3周、6周及12周取材。分別取兩眼之間及其兩側(cè)1 cm范圍內(nèi)全層頭部皮膚組織，分兩部分。其中1/2皮膚入10%中性福爾馬林溶液固定，以行石蠟包埋切片；另1/2皮膚入液氮，以行OCT包埋，冰凍切片（圖1）。

1.3.3 冰凍切片的制備、染色

標(biāo)本放入液氮，OCT包埋，冰凍切片機(jī)切片，厚度約8 μm。每個(gè)標(biāo)本切2張。一張切片封片劑封片后，直接于熒光顯微鏡下觀察，同一視野下拍攝熒光照片，DAPI照片，以示蹤注射的GFP小鼠成纖維細(xì)胞。另一張切片用HE快速染色法染色。以熒光、DAPI照片為參照拍攝HE照片，以便確定熒光所在組織層次。

1.3.4 GFP蛋白的免疫組化檢測(cè)[3]

石蠟切片脫蠟，通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)GFP小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)的GFP蛋白，以便確定注射的成纖維細(xì)胞的存在。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17．0軟件包對(duì)各組定量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)觀察

GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞在DMEM全培養(yǎng)液中單層培養(yǎng)，剛貼壁時(shí)呈三角形，隨著生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而呈梭形和紡錘形（圖2）。

2.2 活體熒光成像結(jié)果

2.2.1 熒光成像觀察結(jié)果

分別于細(xì)胞注射后1周、2周、3周、6周及12周，將各組裸鼠麻醉后，對(duì)每只鼠頭部進(jìn)行活體熒光掃描并采集熒光成像圖（圖3）。直接觀察結(jié)果表明：隨著時(shí)間的推移，熒光面積逐漸減小，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，第12周仍有熒光存在，和陰性對(duì)照比較，提示有少量細(xì)胞存活。

2.2.2 活體熒光信號(hào)定量分析

通過(guò)熒光檢測(cè)儀獲得定量的灰度值，分析表明第1周熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，第2周開(kāi)始大幅減弱，并隨時(shí)間推移，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，但第12周仍有一定的熒光強(qiáng)度，表明有少量的GFP小鼠皮膚成纖維細(xì)胞存活。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，熒光灰度值第1周與第2周、第3周、第6周及第12周均有顯著差異（P＜0．01）；第2周和第3周無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；第2周和第6周、第12周有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）；第3周和第6周無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；第3周和第12周有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）；第6周和第12周也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）（圖4）。

圖3 注射GFP小鼠成纖維細(xì)胞后不同時(shí)間活體熒光成像結(jié)果Fig.3 Living fluorescence imaging at different time after injection

2.3 冰凍切片熒光顯微鏡觀察

結(jié)果表明，第1、2周可明顯發(fā)現(xiàn)注射部位GFP成纖維細(xì)胞發(fā)出的綠色熒光，主要集中在皮下肌肉交界處。第3、6周仍可發(fā)現(xiàn)少量熒光 ，第12周僅能發(fā)現(xiàn)極少量細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光（圖5）。

2.4 GFP蛋白免疫組化染色

結(jié)果表明，第1、2周可明顯發(fā)現(xiàn)注射部位GFP蛋白的存在，第3周可發(fā)現(xiàn)注射部位少量GFP蛋白的存在，第6周、12周僅能發(fā)現(xiàn)極少量GFP蛋白的存在（圖6）。

圖4 每組裸鼠頭部活體熒光檢測(cè)的灰度強(qiáng)度均值Fig.4 Mean grey level of living fluorescence imaging at different groups

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)取材冰凍切片熒光顯微鏡觀察結(jié)果（100×）Fig.5 The distribution and survival of GFP-labeled fibroblasts at different time under the fluorescence microscope(100×)

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)取材石蠟切片GFP免疫組化染色結(jié)果（100×）Fig.6 GFP immunohistochemistry of GFP-labeled fibroblasts at different time

3 討論

傳統(tǒng)的研究細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的方法[4]是標(biāo)記移植細(xì)胞，然后檢測(cè)其標(biāo)記物。傳統(tǒng)標(biāo)記細(xì)胞的方法在研究細(xì)胞轉(zhuǎn)歸時(shí)存在局限性。

使用胞漿標(biāo)記物，常用的主要有Hoechst、Dil等熒光色素細(xì)胞移植前用熒光素進(jìn)行預(yù)先標(biāo)記，移植后可以利用熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記細(xì)胞的存活和遷移情況，熒光色素已經(jīng)被廣泛用于細(xì)胞的標(biāo)記和追蹤方面的研究，但存在以下不足：①隨著細(xì)胞的分裂，標(biāo)記物也幾乎等份地分配給兩個(gè)子細(xì)胞，子細(xì)胞的熒光強(qiáng)度也隨之下降；②只能靠觀察到的熒光判斷細(xì)胞的存在，而難以觀察細(xì)胞形態(tài)及存活狀態(tài)。

使用核酸標(biāo)記物，常用的有胸腺嘧啶同位素標(biāo)記、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記等，是反映細(xì)胞增殖及跟蹤監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞的理想指標(biāo)，但標(biāo)記準(zhǔn)確性及標(biāo)記率存在差異。標(biāo)記細(xì)胞如果發(fā)生凋亡或死亡，其釋放的BrdU則可滲入到處于細(xì)胞循環(huán)S期的任何細(xì)胞，從而難以區(qū)分移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞，出現(xiàn)假陽(yáng)性。

改變細(xì)胞基因使其表達(dá)特異性的標(biāo)志物，但經(jīng)過(guò)基因修飾的細(xì)胞遺傳特性并不穩(wěn)定，可能在分析正常基因?qū)ψ哟?xì)胞分化方向時(shí)產(chǎn)生影響，或在移植后生成腫瘤。

由于傳統(tǒng)標(biāo)記細(xì)胞方法的局限性，本研究選擇了綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚成纖維細(xì)胞作為研究對(duì)象，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠其細(xì)胞可以正常培養(yǎng)，分裂擴(kuò)增，其細(xì)胞活力不受細(xì)胞標(biāo)記物的影響，其細(xì)胞內(nèi)均含GFP蛋白，細(xì)胞熒光不會(huì)隨細(xì)胞分裂而衰減，其熒光不會(huì)隨時(shí)間而減弱，其死亡后代謝消失，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

檢測(cè)細(xì)胞存在的手段很多，受影響的因素也很多，單一檢測(cè)會(huì)存在假陽(yáng)性或假陰性，本研究采用了多種檢測(cè)手段相結(jié)合的方法，以避免上述結(jié)果的出現(xiàn)。

活體動(dòng)物可見(jiàn)光成像儀器可以達(dá)到對(duì)活體熒光的定性和定量檢測(cè)，不易出現(xiàn)假陰性，注射部位有熒光，而非注射部位無(wú)熒光，可清晰表明注射部位細(xì)胞的存活情況及存活量。GFP蛋白質(zhì)本身發(fā)光，冰凍切片熒光顯微鏡下直接觀察注射細(xì)胞后熒光的存在，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，如果切片沒(méi)有切到注射部位，也可能出現(xiàn)假陰性。GFP小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)含GFP蛋白質(zhì)，通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)，在裸鼠頭皮的注射細(xì)胞部位，檢測(cè)GFP小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)的GFP蛋白，以便確定注射的成纖維細(xì)胞的存在。免疫組化同樣也存在假陽(yáng)性和假陰性。

故本研究以GFP小鼠成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，將3種方法相結(jié)合，以提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，為細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)歸的研究提供了一種有效的手段。

目前自體成纖維細(xì)胞注射除皺在歐洲廣泛應(yīng)用于臨床，美國(guó)也進(jìn)入3期臨床。其特點(diǎn)是對(duì)細(xì)紋、淺紋、痤瘡后凹陷性瘢痕治療效果較好，對(duì)深皺紋和面部凹陷的治療效果不盡人意。

本研究結(jié)果顯示，皮膚成纖維細(xì)胞皮下局部注射后2周內(nèi)明顯存在，12周后僅有少量細(xì)胞存活，故單純皮下注射成纖維細(xì)胞，并依賴(lài)其存活，從而達(dá)到除皺的效果是十分有限的。而注射自體成纖維細(xì)胞，對(duì)細(xì)紋、淺紋、痤瘡后凹陷性瘢痕產(chǎn)生較好效果可能是由于多次創(chuàng)傷刺激組織增生而達(dá)到的。

組織工程[5－6]是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，研究和開(kāi)發(fā)用于修復(fù)和改善人體各種組織或器官損傷后功能和形態(tài)的一門(mén)新興學(xué)科，核心就是建立細(xì)胞與生物材料的三維空間復(fù)合體，即具有生命力的活體組織，用以對(duì)病損組織進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達(dá)到永久性替代。根據(jù)組織工程研究發(fā)現(xiàn)[7－8]，沒(méi)有和生物材料的結(jié)合，單純細(xì)胞注射皮下成活量有限，且無(wú)法形成具有三維結(jié)構(gòu)的組織，產(chǎn)生除皺的填充效果。而和生物支架材料相結(jié)合，細(xì)胞存活率明顯提高，并可再生新的三維組織。為了提高本研究中成纖維細(xì)胞的成活率，及除皺時(shí)的填充效果，下一步可以將成纖維細(xì)胞和可降解的生物材料結(jié)合進(jìn)行進(jìn)一步研究。

[1] Homicz MR,Watson D.Review of injectable materials for soft tissue augmentation[J].Facial Plast Surg,2004,20(1):21-29.

[2] Watson D,Keller GS,Lacombe V,et al.Autologous fibroblasts for treatment of facial rhytids and dermal depression[J].Arch Facial Plast Surg,1999,1(3):165-167.

[3] Matsuo S,Kurisaki A,Sugino H,et al.Analysis of skin graft survival using green fluorescent protein transgenic mice[J].Med Invest, 2007,54(3-4):267-275.

[4] 金旭紅,楊柳.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記及活體示蹤技術(shù)研究進(jìn)展[J].中華創(chuàng)傷雜志,2007,23(4):311-313.

[5] Boss WK Jr,Usal H,Chernoff G.Autologous cultured fibroblasts as cellular therapy in plastic surgery[J].Clin Plastic Surg,2000,27 (10):613-626.

[6] Boss WK Jr,Usal H,Fodor PB,et al.Autologous cultured fibroblasts: a protein repair system[J].Ann Plast Surg,2000,44(5):536-542.

[7] 張滌生.組織工程學(xué)簡(jiǎn)介[J].中華整形燒傷外科雜志,1998,14(3): 211-214.

[8] Langer R,Vacanti JP.Tissue engineering[J].Science,1993,260 (5110):920-926.

Research on prognosis of fibroblast after injection In vivo

DING Xiaobang,WANG Jian,CAO Yilin.

Plastic Surgery Hospital,Peking Union Medical College,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China.Corresponding author:Cao Yilin(E-mail:Yilincao@yahoo.com).

Objective To investigate the prognosis of mouse C57BL/6-GFP fibroblast after injection in vivo.Methods Fibroblasts were derived from Green Fluorescent Protein(GFP)transgenic mice.The 3rdpassage of fibroblasts were harvested and injected subcutaneously into the scalp of nude mice with density of 20×106cells/mL.Night OWL LB983 imaging system, fluorescence microscope,histological examination and GFP immunohistochemistry were used to investigate the prognosis of the fibroblasts around the injection area at 1,2,3,6 and 12 week after injection.Results Large amount of fibroblasts were observed 2 weeks after injection,less fibroblasts were observed 3 weeks after injection and only a few fibroblasts were found 12 weeks after injection.As time went by,a few fibroblasts could be detected.Conclusion The fibroblast injection is not indication for facial rejuvenation.

Green Fluorescent Protein;Fibroblast; Hypodermic injection;Prognosis

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年6月16日；

2011年7月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

北京市科委科技計(jì)劃重大項(xiàng)目（D090800046609003），衛(wèi)生部部屬醫(yī)院臨床學(xué)科重點(diǎn)項(xiàng)目,國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目 (30801192)，北京市自然科學(xué)基金（7102134），高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金（新教師基金課題, 200800231078）。

100144 北京市 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院。

曹誼林（E-mail:yilincao@yahoo.com）。