張 戰(zhàn),朱 波綜述,林治華△審校

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院 400054;2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所,重慶 400037)

生物芯片技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用*

張 戰(zhàn)1,朱 波2綜述,林治華1△審校

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院 400054;2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所,重慶 400037)

蛋白質(zhì)陣列分析;寡核苷酸序列分析;組織芯片;生物芯片

惡性腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人類健康的多發(fā)病和常見病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2003年公布的數(shù)據(jù),2000年全球共有惡性腫瘤患者1 000萬,其中男530萬,女470萬,因惡性腫瘤死亡者高達(dá)620萬,占總死亡人數(shù)的12%,在多數(shù)發(fā)達(dá)國家可達(dá)25%,在居民死亡原因中居第1位。如果這一趨勢得不到改善,預(yù)期到2020年,全球每年新發(fā)病例將達(dá) 1 500萬[1]。面對這一嚴(yán)峻的局面,全球早已聯(lián)合行動抗擊惡性腫瘤。從惡性腫瘤臨床診斷、治療的歷史和現(xiàn)狀分析可見,科學(xué)技術(shù)革命對腫瘤治療進(jìn)展起著重要作用。

生物芯片(biochip)技術(shù)是生命科學(xué)與微電子等學(xué)科相互交叉發(fā)展起來的一門高新技術(shù),是隨著人類基因組計劃(human genomic project,HGP)的研究發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生的。20世紀(jì)90年代初,美國斯坦福大學(xué)的學(xué)者提出芯片的概念并進(jìn)行序列的研究,到1996年底,第1塊生物芯片問世。生物芯片主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng),以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。生物芯片技術(shù)的發(fā)展迅速,并且在基因表達(dá)、基因突變及多態(tài)性分析、疾病診斷、藥物篩選、序列分析等領(lǐng)域已顯示出重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價值。生物芯片技術(shù)作為電子學(xué)和生命科學(xué)結(jié)合產(chǎn)生的高科技杰作,雖然誕生僅僅幾年的時間,卻引起人們的廣泛關(guān)注,它將給傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)帶來一場新的革命。從最早開始研究至今,生物芯片已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)的篩選、特異性抗原抗體的檢測、蛋白質(zhì)相互作用的研究、新藥的研制開發(fā)、疾病研究等多個領(lǐng)域,尤其在臨床醫(yī)學(xué)方面,對某些疾病特別是腫瘤及遺傳性疾病的相關(guān)蛋白識別上取得了一系列突破性進(jìn)展。常用的生物芯片分為3類,即基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和組織芯片。本文主要就其在腫瘤研究中的應(yīng)用作一簡要綜述。

1 生物芯片的概念及分類

1.1 基本概念 生物芯片由美國Affymetrix公司首先開發(fā),在短短數(shù)年中生物芯片技術(shù)進(jìn)步迅速,并呈現(xiàn)發(fā)現(xiàn)高峰。所謂生物芯片是由固定于不同種類支持介質(zhì)上的高密度寡核苷酸分子、基因片段或多肽分子的微陣列組成,其中每個分子的位置及序列為已知,當(dāng)熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的探針分子結(jié)合后,可通過激光共聚焦熒光掃描或電荷耦聯(lián)攝影像機(jī)(CCD)對熒光信號強(qiáng)弱的檢測而判斷樣本中的靶分子數(shù)量,以實(shí)現(xiàn)對化合物、核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速和大信息量的篩檢,其特點(diǎn)是高度平行性、多樣性、微型化和自動化[2]。

1.2 生物芯片的制備 制備生物芯片的固相介質(zhì)有玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、硝酸纖維素膜、尼龍膜等。目前較為常用的是玻片。按照生物芯片上使用探針的不同,生物芯片分為基因芯片和蛋白質(zhì)芯片?；蛐酒前压押塑账峄虬蠨NA作為探針,可以對大量不同靶DNA進(jìn)行分析,也可以對同一靶DNA進(jìn)行不同探針序列的分析?；蛐酒址Q為DNA芯片、DNA陣列。按芯片上探針的不同,生物芯片可分為基因芯片和蛋白質(zhì)(肽)芯片。如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探針或靶DNA,則稱為基因芯片;如果芯片上固定的是肽或蛋白質(zhì),則稱為蛋白質(zhì)芯片或肽芯片。在合成探針之前要在支持物表面鍵合上各種各樣的活性基因,如羥基或氨基,以便與配基共價結(jié)合形成具有不同生物特異性的親和載體,用來固定各種不同的活性生物探針,如蛋白質(zhì)、核酸、酶、多肽、抗原、抗體等。1.3 生物芯片的分類 目前生物芯片主要包括基因芯片、蛋白芯片及組織芯片3類[3-4]。基因芯片作為目前研究最多的一種生物芯片,是利用核酸雜交原理檢測未知分子,基因芯片是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針,有規(guī)律地排列固定于支持物上,然后與待測標(biāo)記樣品的基因按堿基配對原理進(jìn)行雜交,再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描,并配以計算機(jī)系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號進(jìn)行比較和檢測,從而迅速得出所要的信息。蛋白質(zhì)芯片也叫蛋白質(zhì)微陣列(protein microarray),它和基因芯片一樣,同屬于生物芯片的范疇,一般包括固相載體、芯片表面介質(zhì)及芯片的檢測設(shè)備3個基本組成部分[5]。組織芯片是由美國科學(xué)家 Kononen等[6]首次提出的。它是指將數(shù)十個、數(shù)百個乃至上千個小的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計的順序整齊地排列在某一載體上(通常是玻片)而成的微縮組織切片,是一種高通量、多樣本的分析工具。這樣就使科研人員一次有可能同時對幾百種其至上千種正常或疾病組織樣本,以及疾病發(fā)展不同階段的自然病理生理狀態(tài)下的組織樣本進(jìn)行某一個或多個特定的基因及與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研究。

2 生物芯片在腫瘤治療中的應(yīng)用

2.1 基因芯片在腫瘤治療中的應(yīng)用 基因芯片應(yīng)用面很廣,其應(yīng)用主要概括為質(zhì)和量的檢測[7]。質(zhì)的檢測:包括DNA測序及再測序、基因突變和單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測等,主要用寡核苷酸芯片完成;量的檢測:包括檢測mRNA水平、病原體的有無及比較基因組中基因的拷貝數(shù)等,量的檢測既可用寡核苷酸芯片,又可用 DNA文庫(cDNA)芯片完成,但cDNA芯片更具優(yōu)勢。由于DNA芯片可以同時對多個基因進(jìn)行檢測和分析,并且可以直接檢測mRNA的種類及豐富度,因此它是研究基因表達(dá)的一種強(qiáng)有力的工具。

Alon等[8]用代表6 500個基因的寡核苷酸芯片研究結(jié)腸癌基因表達(dá)譜,并且通過表達(dá)譜數(shù)據(jù)對基因和組織進(jìn)行聚類分析,廣泛提示了基因表達(dá)圖譜的相關(guān)性。通過這種方法,可將基因分成功能群,用于疾病發(fā)生及臨床診斷等方面研究。Maqani等[9]通過分子切割對上消化道腺癌17q12擴(kuò)增子的研究發(fā)現(xiàn),UGCs區(qū)的PPP1R1B/DA RPP-32和GRB7與轉(zhuǎn)錄活性的瘤原性區(qū)域相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)N-甲基天冬氨酸受體2B(NMDAR2B)在人類食管癌可以抑制腫瘤活性。NMDAR2B受體甲基化在食管癌中可終止基因轉(zhuǎn)錄并能抑制細(xì)胞凋亡。Imazawa等[10]鑒定 Ca2+凝結(jié)蛋白 S100A2是 p53同系物deltaNp63新發(fā)現(xiàn)的下游調(diào)節(jié)蛋白,其過表達(dá)在食管鱗狀上皮細(xì)胞癌中經(jīng)常被觀察到,可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。Pollack等[11]分別用 Cy 5和Cy 3標(biāo)記來自乳腺癌和卵巢癌患者及健康者細(xì)胞的DNA樣品,然后與來自乳腺癌和卵巢癌患者及健康者細(xì)胞的cDNA構(gòu)成的微陣列雜交,分析了與乳腺癌和卵巢癌的發(fā)展有關(guān)的基因。

2.2 蛋白質(zhì)芯片在腫瘤治療中的應(yīng)用 Banez等[12]通過Ciphergen公司的蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)產(chǎn)生正常血清內(nèi)的蛋白質(zhì)譜,隨后使用該公司的生物標(biāo)志模式軟件分析。在他們的研究中,106例前列腺癌患者和56位健康者被隨機(jī)分為推算組(44例患者和30位健康者組成,用于建立決定樹算法)和檢測組(62例患者和26位健康者組成,用于決定樹算法的檢驗(yàn)),結(jié)果表明,聯(lián)合弱陽離子芯片和銅離子芯片所得質(zhì)譜資料建立的算法用于前列腺癌,其敏感性和特異性均為85%。該研究認(rèn)為兩種芯片的聯(lián)合應(yīng)用可以大大提高蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的檢測效力。據(jù)Petricoin等[13]報道,用疏水性C16芯片對50例對照組(卵巢囊腫13例,健康者37位)和50例卵巢癌(Ⅰ期6例,Ⅱ～Ⅳ期44例)患者血清進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在質(zhì)/荷比值為534、989、2 111、2 251和2 465處的5個峰的同時變化,對于診斷具有重要意義。Li等[14]將192例血清標(biāo)本(乳腺癌組126例,其中 T0期4例、T1期 38例、T2期 37例、T3期 24 例、T4期23例;非癌組包括41位健康女性和25例良性乳腺疾病患者)點(diǎn)樣在金屬螯合芯片上,然后用PBS-Ⅱ型閱讀儀讀片,并用專用生物標(biāo)志物模式軟件分析結(jié)果。通過研究3個蛋白質(zhì)的組合可以較理想地將早期乳癌組(T0、T1)和非癌組鑒別開來。交叉驗(yàn)證敏感性為93%、特異性為91%。顯示了其用于乳腺癌早期檢測的巨大潛力。

2.3 組織芯片在腫瘤治療中的作用 師建國等[15]用胃癌組織芯片研究了抗凋亡蛋白BAG21在胃癌中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中,BAG21的表達(dá)率顯著高于正常胃黏膜組織及胃癌旁增生組織(P＜0.01)。在不同分化程度的胃癌組織中BAG21的表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)?？梢夿AG21的表達(dá)只是胃癌發(fā)生的早期分子事件,故可作為胃組織發(fā)生癌變的早期診斷指標(biāo)。Al-Taie等[16]在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)存在硒蛋白p基因突變和轉(zhuǎn)錄異常,提示硒蛋白p基因是人體的一種保護(hù)性因子。黏液素的表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后有關(guān),在用于估計胃癌預(yù)后時,各種文獻(xiàn)報道不一。Zhang和Zhang[17]為了比較Maspin蛋白在不同腫瘤組織中表達(dá)與其功能情況,構(gòu)建了一個含有400例(包括8種腫瘤)腫瘤組織和22份正常組織的芯片。通過免疫組化技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Maspin蛋白存在于大多數(shù)正常組織中,但在其相應(yīng)的惡性組織中,含量普遍下降。另外,他們還通過針對p5～53蛋白與Maspin蛋白進(jìn)行雙標(biāo)記染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變的p53蛋白與Maspin蛋白的含量之間呈負(fù)相關(guān),從而推測Maspin蛋白的表達(dá)與p53蛋白相關(guān)。

3 問題及展望

近年來生物芯片的進(jìn)展迅速,并且也展示了其獨(dú)特的優(yōu)越性,但仍面臨一些問題有待解決。目前面臨的主要問題:(1)技術(shù)成本高,需一系列昂貴的尖端儀器,如光刻機(jī)器和寡核苷酸合成儀,激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備;(2)現(xiàn)在通常采用熒光標(biāo)記待測物技術(shù)檢測信號,而熒光檢測信噪比較低,檢測靈敏度有限;(3)由于在固相上雜交,探針的合成與固定比較復(fù)雜,特別對于制作高密度的探針陣列,并且在同一個芯片上存在多種探針,一種探針雜交最適條件未必適于另一種探針,復(fù)雜的探針易自身形成二、三級結(jié)構(gòu),從而影響雜交,出現(xiàn)錯誤的陰性信號?；蛐酒卺t(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景無疑是非常廣闊的,但要成為實(shí)驗(yàn)室或臨床可以普遍采用的技術(shù)仍有一些關(guān)鍵問題需要解決:(1)現(xiàn)階段芯片檢測的靈敏度決定了需要首先擴(kuò)增模板,一般采用PCR方法,不可避免地會受到PCR所具有的局限性的影響;(2)目前采用的熒光標(biāo)記方法存在檢出靈敏度低的問題;(3)芯片雜交的條件高度個體化,難以形成比較統(tǒng)一、規(guī)范的雜交環(huán)境,給應(yīng)用帶來障礙。雖然蛋白質(zhì)芯片已經(jīng)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域取得了一系列令人可喜的成果,但相對于基因芯片的進(jìn)展速度,它的研究進(jìn)展顯得相對滯后,主要有以下問題亟待解決:用于點(diǎn)制芯片表面蛋白質(zhì)的制備和純化問題;固相載體材料表面的修飾方法;試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)報告的規(guī)范化;大量數(shù)據(jù)的處理、分析軟件的開發(fā);高度集成化樣品制備及檢測儀器的研制和開發(fā)。組織芯片的發(fā)展也還存在著一些急需解決的問題:(1)與組織芯片應(yīng)用相配套的讀片系統(tǒng)、信息處理系統(tǒng)還不夠完善,現(xiàn)在基本上還是人工處理,但是由于組織芯片小,樣本數(shù)量多,人工觀察和分析的難度較大,且分析所得結(jié)果也存在一定的個體差異;(2)組織芯片的制備、染色和檢測方法還有待探索,如樣本的大小、組織的準(zhǔn)確定位、假陽性的剔除等。隨著國內(nèi)外學(xué)者的共同努力,生物芯片技術(shù)的一些缺陷將得到改善,并且其商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化速度也將大大加快,生物芯片在其他領(lǐng)域的潛力也會被更好地發(fā)掘出來,為今后的研究工作帶來極大方便,總之,生物芯片將對人類生活產(chǎn)生極其廣泛、深遠(yuǎn)的影響。

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