舒天麗 楊華元

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海市浦東新區(qū)蔡淪路1200號(hào)，201203)

中醫(yī)針灸學(xué)是中華民族幾千年來防病治病經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶，它在治未病方面有著絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就已經(jīng)提到“上工治未病”。免疫機(jī)能正常與否是決定機(jī)體的健康或疾病的關(guān)鍵，如果免疫機(jī)能正常就可以“防未病”“調(diào)欲病”“治已病”。影響機(jī)體免疫功能下降具有多種因素，如環(huán)境衛(wèi)生、藥物影響、社會(huì)和工作壓力，以及個(gè)人的衣食住行、生活方式等。穴位激光照射法對(duì)免疫功能低下疾病的治療，具有無痛、無菌、安全、易于臨床施治、對(duì)于年老體弱和懼針者更為適宜的優(yōu)勢(shì)。預(yù)處理的治療方式在改善和提高免疫功能低下的同時(shí)，在其他方面也有諸多優(yōu)勢(shì)，如減少醫(yī)療費(fèi)用和藥物對(duì)機(jī)體的毒副作用等，并可提高治療后的康復(fù)速度，所以探索有效的提高免疫功能的預(yù)處理治療方法，是當(dāng)今重要的醫(yī)學(xué)研究課題，也是中醫(yī)治病救人的預(yù)防醫(yī)學(xué)精神的體現(xiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

新西蘭種雄性大白兔20只，體重(2.8±0.2)kg，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(滬)2009-0018，于上海寶牧實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買;上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用許可證編號(hào):SYXK(滬)2009-0069。所有動(dòng)物在同等標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境內(nèi)養(yǎng)育，給以自然飲水和飲食，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境1周。根據(jù)體重將兔編號(hào)，按照SAS9.0產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字表將20只兔隨機(jī)分為2組，穴位照射預(yù)處理組(預(yù)處理組)和假照射對(duì)照組(對(duì)照組)，每組10只。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑和儀器 環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)(0.2g)，購(gòu)自德國(guó)Baxter Oncology GmbH公司。自行研制一臺(tái)2路810nm低強(qiáng)度10mW激光照射治療儀。810nm低強(qiáng)度、持續(xù)波激光通過光纖輸出聚合照射于穴位。激光輸出端與動(dòng)物皮膚之間距離始終保持實(shí)驗(yàn)過程中干預(yù)的一致性。2路激光照射治療儀保持雙側(cè)足三里穴同時(shí)照射45s的一致性。

2.2 造模 穴位照射預(yù)處理組實(shí)驗(yàn)共15d，包括造模前預(yù)處理治療、造模、造模后假照射3個(gè)階段:第1～5d進(jìn)行造模前干預(yù)，提高機(jī)體免疫功能，干預(yù)方法為激光(波長(zhǎng) 810nm，功率 10mW，持續(xù)波)同時(shí)照射雙側(cè)足三里穴［1］2 次/d，45s/次(4J/cm2)，2 次照射間隔時(shí)間3h;第6～10d進(jìn)行動(dòng)物造模，造模方法參照文獻(xiàn)［2］，2組通過兔耳緣靜脈注射環(huán)磷酰胺復(fù)制白細(xì)胞(WBC)減少癥模型。每0.2g環(huán)磷酰胺加10mL生理鹽水。75%乙醇棉球消毒兔耳緣皮膚，將環(huán)磷酰胺溶液(2.5mL/kg體重)緩慢推入兔耳緣靜脈，隔天注射，共3次，讓兔體重減輕，身體虛弱，WBC計(jì)數(shù)正常范圍為7×109～13×109/L，直至WBC數(shù)量下降至低于注射前的60%，并能保持5～6d白細(xì)胞減少癥的現(xiàn)象，作為造模成功的標(biāo)志。第11～15d進(jìn)行造模后假激光照射，將激光置于雙側(cè)足三里穴，但不進(jìn)行照射(2次/d，45s/次，2次間隔時(shí)間 3h)。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)共 10d，包括造模、造模后假照射2個(gè)階段:第1～5d動(dòng)物造模，方法同預(yù)處理組;6～10d進(jìn)行假激光照射。2組照射前及隨后3h測(cè)量動(dòng)物白細(xì)胞計(jì)數(shù)，進(jìn)行當(dāng)天的第2次穴位照射或假照射。各組在假照射期間的第5d，測(cè)完第2次白細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加測(cè)T、B淋巴細(xì)胞比值。

2.3 測(cè)外周血WBC計(jì)數(shù)方法 安靜環(huán)境中，室溫22℃，將兔固定于兔架上，耳廓背面剪去毛發(fā)以備采血，用手術(shù)燈照射耳部，使血管擴(kuò)張便于取血。75%乙醇棉球耳緣靜脈區(qū)消毒后，用一次性靜脈輸液針耳緣靜脈放血，一次性微量吸管采血20μL，放入量杯搖勻后，滴入溶血素4滴再搖勻，用血球計(jì)數(shù)儀測(cè)WBC計(jì)數(shù)。預(yù)處理組WBC計(jì)數(shù)檢測(cè)為:1)實(shí)驗(yàn)開始前，檢測(cè)動(dòng)物正常WBC計(jì)數(shù)，測(cè)后造模;2)造模期間(共5d)的第3、5d注射環(huán)磷酰胺之前再測(cè);3)造模后期(即造模后，共5天)，每天假照射前后采血檢測(cè)(包括當(dāng)天首次治療前和3h后再次治療前)。對(duì)照組WBC計(jì)數(shù)測(cè)定時(shí)間為:1)實(shí)驗(yàn)開始前，檢測(cè)動(dòng)物正常WBC計(jì)數(shù)，測(cè)后造模;2)造模期的第3、5d注射環(huán)磷酰胺之前測(cè)定;3)造模后期，每天假照射前后采血檢測(cè)(包括當(dāng)天首次治療前和3h后再次治療前)。

2.4 測(cè)外周T和B淋巴細(xì)胞方法 測(cè)完第2次WBC計(jì)數(shù)后，測(cè) T、B淋巴細(xì)胞比值。安靜環(huán)境中，室溫22℃，75%乙醇棉球耳緣靜脈區(qū)消毒后，從耳緣靜脈用一次性注射器抽取0.8mL血置于含有抗凝劑的離心管中，用流式細(xì)胞儀測(cè)T、B淋巴細(xì)胞。

表1 預(yù)處理組與對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)的WBC計(jì)數(shù)比較(ˉx±s，G/L)

表2 同組家兔不同時(shí)間點(diǎn)的WBC比較(ˉx±s，G/L)

圖1 預(yù)處理組與對(duì)照組間WBC計(jì)數(shù)的比較

圖2 2組之間CD3+T淋巴細(xì)胞與CD19+B淋巴細(xì)胞構(gòu)成比較

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，則采用ˉx±s表示;若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則采用中位數(shù)、最小值、最大值(M，min，max)表示。統(tǒng)計(jì)推斷:1)WBC計(jì)數(shù)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量(Repeated Measures)數(shù)據(jù)資料的方差分析;2)T、B淋巴細(xì)胞的結(jié)果采用單因素方差分析(One-way Anova)，組間多重比較用LSD(方差齊時(shí))或Dunnett T3(方差不齊時(shí))。

3 結(jié)果

3.1 排除標(biāo)準(zhǔn) 建立WBC低下模型過程中，動(dòng)物因?yàn)閃BC低下，模型動(dòng)物免疫功能衰弱易生病，感冒，泄瀉。故預(yù)處理組中，2只動(dòng)物因拒食和感冒均被排除實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組中3只動(dòng)物也因感冒，泄瀉和不明原因死亡均被排除實(shí)驗(yàn)。

3.2 穴位照射預(yù)處理對(duì)WBC計(jì)數(shù)的影響 采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)資料的方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，預(yù)處理組WBC計(jì)數(shù)與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=11.786，P＜0.001)，各時(shí)間點(diǎn)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=181.977，P＜0.001)，進(jìn)一步多重比較結(jié)果見圖1和表1。由圖1和表1可知，預(yù)處理組與對(duì)照組第1～5天在不同時(shí)間點(diǎn)上的WBC計(jì)數(shù)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3.3 穴位照射預(yù)處理對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的外周血WBC計(jì)數(shù)的影響 同組不同時(shí)間點(diǎn)的WBC計(jì)數(shù)比較見表2。由表2可看出，2組造模后5d時(shí)間內(nèi)的WBC計(jì)數(shù)與造模前WBC計(jì)數(shù)相比有顯著差異(P＜0.01)，其對(duì)照組在5d時(shí)間內(nèi)未恢復(fù)正常WBC水平范圍(7×109～13×109/L)，提示造模成功。預(yù)處理組1～5d WBC計(jì)數(shù)與造模后首測(cè)相比，WBC計(jì)數(shù)連續(xù)的增多，保持極顯著性差異(P＜0.01)，說明有減少免疫損傷的作用，顯示免疫系統(tǒng)功能從造模后開始而連續(xù)5d繼續(xù)向康復(fù)水平改善的過程。預(yù)處理組在3d假照射前WBC計(jì)數(shù)就已恢復(fù)到正常范圍(7×109～13×109/L)。對(duì)照組與造模后首測(cè)自相對(duì)比，1d、2d WBC計(jì)數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在第3d才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示動(dòng)物受到環(huán)磷酰胺的毒害損傷，使免疫功能恢復(fù)相對(duì)緩慢，而未恢復(fù)到正常WBC水平范圍(7×109～13×109/L)。說明，穴位照射預(yù)處理有減少免疫損傷，縮短康復(fù)時(shí)間的功效。

3.4 穴位照射預(yù)處理對(duì)外周T、B淋巴細(xì)胞百分比含量比較的影響 由表3、圖2可知，造模后5d，預(yù)處理組與對(duì)照組相比CD3+T細(xì)胞顯著增多，差異具有極顯著性(P＜0.01);CD19+B細(xì)胞顯著降低，差異有顯著性意義(P＜0.05)。預(yù)處理組與對(duì)照組相比T/B細(xì)胞的比值向正常范圍回升。

表3 外周血CD3+T、CD19+B淋巴細(xì)胞百分比含量(xˉ±s)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺減低WBC指標(biāo)作為免疫功能低下動(dòng)物模型。環(huán)磷酰胺造模方法簡(jiǎn)單易行，用量及時(shí)間可靈活掌握，故是常用的經(jīng)典性制造免疫功能低下實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆椒?。本研究觀察外周WBC計(jì)數(shù)在穴位預(yù)處理照射中的免疫作用，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理組照射足三里穴在造模后階段有使WBC計(jì)數(shù)增多的顯著作用，并縮短了康復(fù)時(shí)間，WBC數(shù)目在第3天已恢復(fù)到正常范圍(7×109～13×109/L)。同時(shí)，對(duì)照組WBC計(jì)數(shù)也天然增多，但并未恢復(fù)到正常范圍之內(nèi)，也未恢復(fù)到該組造模前的WBC計(jì)數(shù)水平。預(yù)處理組與對(duì)照組相比，T細(xì)胞顯著增多(P＜0.01)，B細(xì)胞顯著降低(P＜0.05)，T/B細(xì)胞的比值回升。在造模后第5d，預(yù)處理組的T/B細(xì)胞的比值已回升到正常范圍，表明預(yù)處理“足三里”能刺激T細(xì)胞的生長(zhǎng)、B細(xì)胞的減少、調(diào)節(jié)T/B細(xì)胞的比值。

足三里穴是胃之合穴，有益脾胃、助運(yùn)化、理氣和血、祛邪防病的功效。中醫(yī)理論認(rèn)為，脾胃為后天之本，氣血化生之源，陽(yáng)明又為多氣多血之經(jīng)，所以刺激胃經(jīng)合穴足三里可調(diào)氣補(bǔ)血，是治療疾病的關(guān)鍵穴位。現(xiàn)代研究反復(fù)證明，足三里穴有促進(jìn)和調(diào)節(jié)免疫功能的作用［2-6］。所以本實(shí)驗(yàn)采用能雙補(bǔ)氣血的“足三里”穴，也是根據(jù)對(duì)該穴的相對(duì)特異性、以及現(xiàn)代免疫機(jī)制而決定的。

近年針灸界提出了“針灸預(yù)處理”一詞，所謂針灸預(yù)處理，是預(yù)先對(duì)機(jī)體的某些穴位進(jìn)行刺激，以提高機(jī)體的抗病與應(yīng)變能力，使未來可能產(chǎn)生的疾病對(duì)機(jī)體組織器官和功能的損傷有減輕的作用。針灸從本質(zhì)上講，是一種物理刺激方法［7］，采用不同方法來刺激穴位都可達(dá)到激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，協(xié)調(diào)陰陽(yáng)、調(diào)節(jié)機(jī)體功能的目的。預(yù)處理組的減少免疫損傷和縮短康復(fù)時(shí)間的療效，表明足三里穴在激光預(yù)處理時(shí)，對(duì)“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)”功能的調(diào)節(jié)作用，具有一定時(shí)間的延續(xù)性。從而推斷，調(diào)節(jié)“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)”功能的預(yù)處理，是針灸預(yù)防治療所強(qiáng)調(diào)的“治未病”的治療手段和治療方案。有鑒于激光照射足三里有提高WBC計(jì)數(shù)的作用，故能對(duì)WBC低下而引起的許多癥狀有重要的良性調(diào)節(jié)作用，有利于疾病的痊愈，故穴位預(yù)處理有其“治未病”的作用。

當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)提倡和發(fā)展預(yù)防醫(yī)學(xué)。而中醫(yī)針灸醫(yī)學(xué)本質(zhì)上是實(shí)用的臨床預(yù)防醫(yī)學(xué)，但到目前為止，在國(guó)際上并未得到足夠的重視和廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)足三里穴激光預(yù)處理治療的初步探討，采用穴位預(yù)處理來調(diào)節(jié)機(jī)體“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)”的治療方法，應(yīng)該是中醫(yī)“治未病”的預(yù)防醫(yī)學(xué)的重要組成部分，今后有必要進(jìn)一步對(duì)針灸預(yù)處理作更深入廣泛的臨床研究，加以提倡。

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