王 帥，王雪峰，林躍智，姜成剛，呂曉玲，趙立平，周建華*，曲娟娟

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大動物病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001)

馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)可以導(dǎo)致馬屬動物患馬傳染性貧血(EIA)，主要表現(xiàn)為持續(xù)感染、反復(fù)發(fā)熱和貧血等癥狀[1]。EIAV基因組全長約8.2 kb，除編碼3個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白外，還編碼3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白Tat、S2和Rev蛋白。其中，S2蛋白的作用機(jī)制尚不明確。但研究表明，S2基因在EIAV感染馬體內(nèi)高度保守；缺失S2基因?qū)?dǎo)致病毒毒力減弱，并使其在體內(nèi)復(fù)制能力明顯降低[2]。而在體外試驗(yàn)中，S2基因的缺失并不影響病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中的復(fù)制[3]。

EIAV驢白細(xì)胞弱毒疫苗EIAVDLV121是將致病性強(qiáng)毒株在體外驢白細(xì)胞中傳代弱化后獲得的，該疫苗具有良好的安全性和誘導(dǎo)免疫保護(hù)效果[4]。我們的研究表明，EIAVDLV121的S2基因與其親本強(qiáng)毒株存在明顯差異，兩者核苷酸和氨基酸序列差異率分別為4.1%和10.4%[5]。由此推測，EIAVDLV121的致弱與S2基因在體外傳代過程中的變異有關(guān)，而關(guān)于EIAVDLV121S2基因在接種馬體內(nèi)的變異情況尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以EIAVDLV121接種實(shí)驗(yàn)馬匹，定期檢測EIA體征，采取樣品，測定并分析EIAVS2基因的序列，以研究EIAVDLV121S2基因在體內(nèi)的變異規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 EIAV疫苗株與實(shí)驗(yàn)動物 驢白細(xì)胞弱毒疫苗株EIAVDLV121由哈爾濱獸醫(yī)研究所大動物研究室慢病毒課題組提供；實(shí)驗(yàn)馬購自黑龍江省某馬場，經(jīng)兩次免疫瓊脂擴(kuò)散法檢測EIAV抗體為陰性。

1.2 主要試劑 QIAamp Viral RNA Mini試劑盒購自QIAGEN公司；M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司。

1.3 接種病毒和血樣采集 將2匹實(shí)驗(yàn)馬于頸部皮下接種EIAVDLV1212×105TCID50/匹，命名為#1、#2；另外2匹作為陰性對照注射等體積生理鹽水。每天檢測直腸溫度和臨床體征，并每隔14 d采集頸靜脈肝素抗凝血，檢測血小板量，3個(gè)月后每隔30 d采集，共持續(xù)5個(gè)月。采用文獻(xiàn)[6]方法測定免疫馬體內(nèi)各時(shí)期的病毒載量。

1.4 病毒RNA的提取和S2基因的擴(kuò)增 按照病毒RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，并以該RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)EIAVDLV121參考序列(AF327878.1)利用軟件 Oligo 6.0設(shè)計(jì) PCR引物(外套引物 P7：5'-CCACCAGTGTTGTGGAAAGGTGA-3'和 P8：5'-T GACCCCATGATTCATTCCA-3'； 內(nèi) 套 引 物 P7-1：5'-TTGTAAGGTTTGGTGTATGGG-3'和 P8-1：5'-AT GGCAGCTATTATAGCAG-3')，通過套式PCR反應(yīng)擴(kuò)增S2基因。將膠回收的目的片段連接于pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取15個(gè)以上的陽性克隆進(jìn)行測序。

1.5 序列分析 利用 DNAStar、Bioedit、ClustalX和MEGA4.0等生物學(xué)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行整理和生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)馬的臨床特征 免疫馬在接種后150 d的檢測期間內(nèi)均未出現(xiàn)EIA的臨床癥狀。其中，#1馬在第24 d、25 d和88 d，#2馬在第3 d、12 d、29 d、88 d、108 d和126 d時(shí)出現(xiàn)一過性體溫升高(0.1℃～0.3℃)。但EIA的其它主要診斷指標(biāo)如血小板數(shù)量和血漿病毒載量均低于發(fā)病閾值(血小板>1×105/μL、病毒載量 1×107copies/mL)(圖 1)，可以排除EIA臨床發(fā)病。

圖1 EIAVDLV121免疫馬體溫、血小板和病毒載量動態(tài)曲線Fig.1 Dynamic curves of temperature,platelet counts and viral RNA copies of immuned horses

2.2 進(jìn)化樹分析 利用MEGA 4.0軟件的Neighbor-Joining方法對免疫馬體內(nèi)各8個(gè)采樣點(diǎn)(14 copies～23 copies/點(diǎn))共202個(gè)S2基因序列以及EIAVDLV121參考序列的26個(gè)S2基因序列和親本強(qiáng)毒株EIAVLN40的18個(gè)S2基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，進(jìn)化樹形成4個(gè)大的分支，其中EIAVDLV121序列位于兩個(gè)分支中，EIAVLN40序列處于另一個(gè)分支中，而#1馬的第1采樣檢測點(diǎn)1-1(數(shù)字組的前部分為馬匹號，后部分為采樣期號)的序列和2-3的序列共處于一個(gè)獨(dú)立的分支中(圖2)。1-5的序列與EIAVDLV121的優(yōu)勢序列親緣關(guān)系最近，2-1和2-2的序列與EIAVDLV的非優(yōu)勢序列處于一個(gè)獨(dú)立的分支中。與EIAVLN40親緣較近的為1-3、1-7和1-8的序列。

2.3 S2推導(dǎo)氨基酸突變位點(diǎn)分析 將測序所得的247個(gè)S2核苷酸序列利用DNAStar軟件轉(zhuǎn)換為氨基酸序列后利用ClustalX進(jìn)行比對分析。EIAVDLV121S2蛋白在免疫馬匹體內(nèi)的氨基酸突變位點(diǎn)主要集中在第17位、22位、39位、41位、51位和55位。免疫前，這些位點(diǎn)在EIAVDLV121中均呈現(xiàn)兩種氨基酸共存的狀態(tài)，而在免疫后各位點(diǎn)趨于單一。#1馬在免疫期內(nèi)，第17位、22位和39位氨基酸均回復(fù)突變?yōu)镋IAVLN40相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸，而第41位、51位和55位，在免疫后期也均回復(fù)突變?yōu)镋IAVLN40的氨基酸；而#2馬僅第17位在免疫后期回復(fù)突變?yōu)镋IAVLN40的氨基酸，第22位由親本E突變?yōu)镵，雖然第39位和第41位在免疫前期回復(fù)突變?yōu)镋IAVLN40的氨基酸，但免疫后期則分別突變?yōu)镋和I，與EIAVDLV121中該位點(diǎn)的優(yōu)勢氨基酸相同(表1)。

2.4 分離株與EIAVLN40S2推導(dǎo)氨基酸序列的遺傳距離分析 將實(shí)驗(yàn)馬各時(shí)期S2推導(dǎo)氨基酸序列與EIAVLN40S2優(yōu)勢序列進(jìn)行比較顯示，#1馬的1-3、1-7和1-8的S2蛋白與EIAVLN40親緣相近，氨基酸平均差異率分別為0.9%、1.3%和0.8%，而該3個(gè)時(shí)期的S2優(yōu)勢序列與EIAVLN40相應(yīng)序列完全相同，其他各時(shí)期S2蛋白與EIAVLN40的平均差異率均在5%以上(圖3)。而#2馬各時(shí)期的序列與EIAVLN40的遺傳距離相對較遠(yuǎn)，差異率最小為3.0%，最大可達(dá)12.5%，但仍存在與EIAVLN40序列接近的時(shí)期(2-3和 2-5，圖 3)。

3 討論

圖2 S2基因進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic trees of S2gene of EIAV

表1 S2蛋白主要氨基酸突變位點(diǎn)分析Table 1 The analysis of principal mutation for amino acid in S2 protein

圖3 馬體內(nèi)不同時(shí)期EIAVDLV121與EIAVLN40S2推導(dǎo)氨基酸遺傳距離(%)Fig.3 The distance from EIAVDLV121and EIAVLN40for amino acid in S2 protein(%)

研究顯示，EIAVDLV121在體外傳代的過程中發(fā)生了多基因、多位點(diǎn)的高頻率變異，使疫苗株在構(gòu)成上成為具有一定差異的準(zhǔn)種混合體，與親本強(qiáng)毒株具有較大差異[5]。其中，差異最大的基因組區(qū)域包括LTR、env以及S2基因。EIAVDLV121作為弱毒疫苗免疫馬后的變異特點(diǎn)尚不清楚。本研究分析EIAVDLV121在免疫馬后S2基因的變異特點(diǎn)，結(jié)果顯示其不斷發(fā)生變異，不同時(shí)間點(diǎn)分離的病毒在S2推導(dǎo)氨基酸水平的平均差異率最大可達(dá)8.0%。進(jìn)化分析顯示，EIAVDLV121免疫馬后不僅含有其原有S2基因型，同時(shí)也有新基因型出現(xiàn)。進(jìn)化樹表現(xiàn)為部分S2基因與EIAVDLV121位于進(jìn)化樹的同一分支，而部分S2基因克隆單獨(dú)形成新分支。

本研究顯示，EIAVDLV121免疫馬匹后在某些時(shí)間點(diǎn)分離病毒的S2基因與親本強(qiáng)毒株EIAVLN40在進(jìn)化樹中處于同一分支，甚至某些克隆的序列是一致的，但免疫馬匹并未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，外周血病毒載量維持在1×105copies/mL以下。高旭等對EIAV弱毒疫苗感染性克隆的S2基因進(jìn)行回復(fù)突變，將其衍生病毒感染馬匹也未引起發(fā)病[7]。表明S2基因單獨(dú)的回復(fù)突變并不能引起病毒毒力的增強(qiáng)，也提示EIAV弱毒疫苗的毒力減弱由多基因變異導(dǎo)致。馬建等研究顯示，EIAVDLV121gp90基因在體內(nèi)進(jìn)化過程中會出現(xiàn)與EIAVLN40相似的病毒變異體，即使進(jìn)行藥物免疫抑制，病毒載量仍保持低拷貝的水平，也無任何EIA臨床癥狀[8]。以上結(jié)果進(jìn)一步表明EIAV弱毒疫苗具有良好的安全性。

本研究顯示EIAVDLV121S2基因在馬體內(nèi)發(fā)生了高水平的變異，這些變異是否改變EIAV弱毒疫苗株在馬體內(nèi)的生物學(xué)特性仍需要深入研究；在體內(nèi)某些時(shí)間點(diǎn)分離病毒的S2基因序列與致病性強(qiáng)毒相同，但并未引起馬匹發(fā)病，表明EIAV弱毒疫苗具有良好的安全性。而關(guān)于EIAV弱毒疫苗其他基因在體內(nèi)變異特點(diǎn)我們將進(jìn)行深入研究。

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