王 哲，王 丹，李 巍，蔡亞楠，楊桂連，趙 權(quán)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

豬帶絳蟲(chóng)(Taenia solium)是常見(jiàn)的人獸共患寄生蟲(chóng)，人既是終末宿主又是中間宿主，可引起豬帶絳蟲(chóng)或人的囊尾蚴病(囊蟲(chóng)病)。該病在我國(guó)北部和西部地區(qū)流行較廣，給畜牧業(yè)帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)損失，并影響公共健康[1]。未激活的豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴經(jīng)人腸液激活后變?yōu)橛懈腥玖Φ牧^蚴，可導(dǎo)致囊蟲(chóng)病和絳蟲(chóng)病，未激活的蟲(chóng)卵由胚膜、內(nèi)胞質(zhì)層、六鉤蚴膜和六鉤蚴等幾部分組成，而六鉤蚴的膜結(jié)構(gòu)僅六鉤蚴膜一層[2-3]，激活后蟲(chóng)體部分蛋白為適應(yīng)新環(huán)境可能發(fā)生變化，其基因表達(dá)會(huì)因?yàn)樗拗鳝h(huán)境的刺激而有所改變，某些致病性也可能只在宿主的體內(nèi)才會(huì)表現(xiàn)。有的蛋白質(zhì)被腸液消化，而有些為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生新的蛋白，比如熱休克蛋白等。從寄生蟲(chóng)感染前后宿主蛋白質(zhì)組的變化來(lái)研究?jī)烧叩南嗷プ饔茫苯影l(fā)現(xiàn)蛋白水平的變化，更有可能找到與病原體致病性直接相關(guān)的標(biāo)記物或在感染過(guò)程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子。研究表明，激活的六鉤蚴蛋白質(zhì)組含7類(lèi)總計(jì)65種蛋白質(zhì)[4-6]。差異蛋白質(zhì)通過(guò)誘導(dǎo)熱休克蛋白，免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)和抗氧化系統(tǒng)的蛋白等的表達(dá)開(kāi)啟了正常的細(xì)胞活性向細(xì)胞保護(hù)功能的轉(zhuǎn)變。差異蛋白質(zhì)組研究在血吸蟲(chóng)和果蠅等侵入宿主機(jī)制的研究中已有應(yīng)用，但至今還未見(jiàn)二維液相色譜分離法應(yīng)用于豬帶絳蟲(chóng)與宿主相互作用研究的報(bào)道。

ProteomeLabTMPF-2D平臺(tái)的二維液相色譜技術(shù)(Two-dimensionalliquid chromatography separation，2D LC)以高效液相色譜為基礎(chǔ)，利用一維色譜聚焦和二維反相色譜分離對(duì)生物組織細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離分析。2D LC技術(shù)與雙向聚丙酰胺電泳(2D-PAGE)相比，具有操控簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)，可通過(guò)不同分離模式的偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中分子大小差別較大的蛋白、低含量的蛋白以及疏水蛋白的分析[4-5]。本研究應(yīng)用2D LC技術(shù)，對(duì)體外模擬腸道內(nèi)的激活過(guò)程和未激活的豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴蛋白質(zhì)組進(jìn)行差異分析，確定激活前后豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴的差異蛋白及蛋白水平的變化，并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)確定氨基酸序列為研究豬帶絳蟲(chóng)的寄生機(jī)制提供方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 二維液相色譜儀Proteme-LabTMPF-2D、ProtemeLabTMPF-2D試劑盒均為Beckman Coulter公司產(chǎn)品[包括高效色譜聚焦柱(HPCF-1D)、無(wú)孔硅膠反相色譜柱(HPRP-2D)、起始緩沖液(Start buffer，SB)、洗脫緩沖液(Eluent buffer，EB)、PD10 G-25脫鹽柱]；PBS緩沖液次氯酸鈉和硫代硫酸鈉購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；Percoll液購(gòu)自Sigma公司；新鮮豬膽汁購(gòu)于長(zhǎng)春市南關(guān)區(qū)長(zhǎng)樂(lè)綜合屠宰場(chǎng)；BCA法蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自百奧公司。

1.2 豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴的孵化激活 成熟的豬帶絳蟲(chóng)收集于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院患者，收集的蟲(chóng)卵經(jīng)漂洗，加入0.75%次氯酸鈉作用5 min(鏡檢大多數(shù)蟲(chóng)卵破殼)，加入0.2 mol/L硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，沉淀以PBS和Percoll重懸，4℃，1600 g離心20 min，中間層為純化的六鉤蚴。參照文獻(xiàn)[3]激活純化的六鉤蚴，同時(shí)保留未激活的六鉤蚴。

1.3 激活和未激活六鉤蚴可溶性蛋白提取 在激活和未激活的六鉤蚴中各加入200 μL組織裂解液，4℃20000 g離心90 min，收集上清，應(yīng)用BCA法測(cè)定濾液蛋白濃度，并調(diào)整濃度至3.75mg/mL。

1.4 一維色譜聚焦 一維色譜聚焦分離采用初始緩沖液平衡HPCF柱130 min，蛋白樣品量為1 mg，初始緩沖液洗脫20 min，洗脫緩沖液洗脫75 min，每間隔0.3個(gè)pH單位收集1份樣品，共收集樣品16份于96孔深孔板內(nèi)。當(dāng)流出液的pH到達(dá)4.0±0.1時(shí)，依次用10倍柱體積的1 mol/L NaCl和水洗脫HPCF柱。上述過(guò)程由ProteomeLabTMPF-2D的32Karat軟件自動(dòng)控制。收集的樣品供進(jìn)一步的二維色譜分析。

1.5 二維反相高性能液相色譜 溶劑A為0.1%三氟乙酸水溶液，溶劑B為含0.08%三氟乙酸乙腈溶液。以流動(dòng)相A平衡柱子10 min，每個(gè)一維收集樣本進(jìn)樣200 μL，進(jìn)行線(xiàn)性洗脫梯度洗脫，其中洗脫梯度為0～100%B。二維樣品以0.4 min/管收集于96孔深孔板內(nèi)，將分離好的樣品置于-80℃保存?zhèn)溆?，以上過(guò)程由32Karat軟件自動(dòng)控制進(jìn)行。

1.6 PF-2D數(shù)據(jù)分析 利用Maping tools軟件將由HPRP產(chǎn)生的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的ASCII格式的文件轉(zhuǎn)換成VUE格式的文件，并轉(zhuǎn)換成模擬膠圖，以分別展示激活和未激活的豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴蛋白的表達(dá)譜。

2 結(jié)果

2.1 總蛋白質(zhì)提取結(jié)果 激活和未激活的豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴蛋白分別經(jīng)PF-2D一維色譜聚焦分離，各獲得9份不同pH范圍的蛋白質(zhì)組份，將這9個(gè)組份依次進(jìn)行二維反相色譜分析，將得到的色譜數(shù)據(jù)經(jīng)Maping tools軟件處理，獲得的模擬電泳圖結(jié)果表明激活和未激活的豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴蛋白在表達(dá)分布主要集中在pH7.71～pH5.31值之間(圖1)。

圖1 PF-2D液相分離的激活和未激活的豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴總蛋白Fig.1 Separation of activated and nonactivatedT.soliumoncophere total proteins by PF-2D

2.2 不同pH區(qū)域蛋白質(zhì)分布 從PF-2D分離得到的激活和未激活的豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴全部蛋白數(shù)量分布結(jié)果表明，pH值為7.71～5.31的范圍內(nèi)共分離出激活和未激活的豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴蛋白分別為208個(gè)和197個(gè)。其中，在氨基酸等電點(diǎn)(pI)為7.71～7.41之間的pH值區(qū)段中分離得到的未激活的六鉤蚴蛋白多于激活的六鉤蚴蛋白；在pI為7.41～7.11和6.81～6.51范圍內(nèi)的pH值區(qū)段中兩者蛋白數(shù)量相同，其他pH區(qū)域均為激活的六鉤蚴蛋白數(shù)量多于未激活的六鉤蚴蛋白(表1)。

表1 激活和未激活的六鉤蚴總蛋白的分布圖Table 1 Distribution of activated and nonactivated T.soliumoncophere total proteins

2.3 不同pH區(qū)域差異蛋白質(zhì)分布 激活和未激活六鉤蚴全部差異蛋白總計(jì)為77個(gè)，其中激活和未激活六鉤蚴分別為44個(gè)和33個(gè)。全部pH值區(qū)段分離結(jié)果顯示，差異蛋白在pI約6.51～6.21和5.61～5.31之間的pH值區(qū)段中，激活和未激活六鉤蚴差異蛋白數(shù)量明顯(表2)。

表2 激活和未激活六鉤蚴差異蛋白分布圖Table 2 Distribution of activated and nonactivated T.soliumoncophere difference proteins

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究激活和未激活的六鉤蚴蛋白質(zhì)差異，pH值在7.71～5.31的范圍內(nèi)分離獲得相同蛋白164個(gè)，差異總蛋白77，激活的44個(gè)，未激活的33個(gè)，推測(cè)差異蛋白與宿主入寄生蟲(chóng)的適應(yīng)關(guān)系，結(jié)合質(zhì)譜的鑒定和相應(yīng)的功能研究，從寄生蟲(chóng)與宿主相互作用的角度研究寄生蟲(chóng)的毒力因子以及與致病相關(guān)的宿主因子。

差異蛋白質(zhì)組學(xué)作為一門(mén)新興學(xué)科，目前以高效液相色譜方法(HPLC)為主的技術(shù)平臺(tái)，特別是與各種質(zhì)譜串聯(lián)的多維色譜分離技術(shù)逐漸克服了傳統(tǒng)固相2D技術(shù)存在的缺陷，二維液相色譜分離法包括液相狀態(tài)下的色譜聚焦(第一維)及無(wú)孔硅膠反相HPLC分離(第二維)。從第二維洗脫的蛋白質(zhì)可用電噴霧離子阱質(zhì)譜(ESI-MS)直接檢測(cè)，或用基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(MALDI-MS)測(cè)定分離蛋白的完整分子量。二維液相色譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組分離技術(shù)的一種重要補(bǔ)充，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用廣泛[7]。PF2D比普通2D電泳優(yōu)勢(shì)明顯，已經(jīng)逐步作為分離蛋白質(zhì)的主導(dǎo)地位，具有靈敏度高上樣量大自動(dòng)化高等特點(diǎn)[8]，而二維液相色譜分離系統(tǒng)可在溶液狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)完整蛋白質(zhì)的分離和收集[9]。而且二維色譜分離可直接與質(zhì)譜串聯(lián)。在獲得所有完整蛋白質(zhì)pI/UV同譜的同時(shí)可得到高精確的質(zhì)量圖譜[10]。本研究通過(guò)ProteomeLabTMPF-2D目標(biāo)蛋白快速分離系統(tǒng)來(lái)對(duì)激活和未激活六鉤蚴的差異蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了初步研究，并得到了差異蛋白質(zhì)組圖譜，為豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴與宿主關(guān)系的研究提供試驗(yàn)方法。

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