叢 鋒，劉長軍，張艷萍，李志杰，張 鋒，成 云，楊文闖，許娜娜

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001)

馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)為雞和火雞的一種高致瘤性皰疹病毒，能夠在雞羽髓處形成感染性病毒粒子并釋放至環(huán)境中。因此，羽髓上皮細胞對于MDV的增殖和傳播具有重要意義[1]。研究表明，MDV感染后7 d即可在羽髓中檢出病毒，21 d病毒載量達到峰值，之后下降[2]。另外有研究顯示，MDV感染后4 d即引起羽髓中CD4+和CD8+T淋巴細胞浸潤，10 d達到峰值；同時，IL-18、IL-6和IFN-γ等細胞因子在mRNA水平的表達量顯著升高[3-4]。但是目前這些研究均為DNA或mRNA水平進行的個別基因或蛋白質(zhì)的檢測。蛋白質(zhì)組學技術(shù)可以大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)，更真實地反映蛋白質(zhì)的表達情況、翻譯后的修飾以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。因此，本實驗應用蛋白質(zhì)組學方法對MDV感染的雞羽髓上皮細胞進行研究，篩選并鑒定差異表達蛋白，為進一步研究羽髓中MDV的復制、基因的表達以及宿主的應答等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株和實驗動物 MDV強毒GA株購自美國標準菌種收藏所(ATCC)，由本實驗室繼代培養(yǎng)至第5代；1日齡SPF白色來航雞由哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 蛋白定量試劑盒、尿素、硫脲、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、去垢劑CHAPS、IPG干膠條和IPG緩沖液(pH3～pH10)均購自美國安瑪西亞公司；等電聚焦系統(tǒng)(Ettan IPGphorⅢ)、膠條槽(Ettan IPGphor Manifold)、標準垂直電泳系統(tǒng)(SE 600 Ruby)和掃描儀(ImageScanner)均為美國安瑪西亞公司產(chǎn)品。

1.3 動物實驗 將30只1日齡SPF雞隨機分為2組，每組15只。試驗組以2000 pfu/只的劑量腹腔接種MDV GA株；對照組接種等體積PBS。在相同條件下分別于負壓隔離器中飼養(yǎng)。接種后4 d、7 d、14 d和21 d每只雞分別采集4根～5根羽髓凍存于液氮中。

1.4 樣品制備 將羽髓于液氮中充分研磨，每100 mg組織加入0.5 mL裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、2%IPG緩沖液和40 mM DTT)，室溫裂解1 h后，16℃ 15000 g離心30 min，吸取上清液。采用TCA-丙酮沉淀法濃縮蛋白，使用蛋白定量試劑盒測定濃度，進行等電聚焦或-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雙向電泳(2DE) 將350 μg樣品稀釋于水化液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2%CHAPS、0.5%IPG緩沖液，0.002%溴酚藍和20 mM DTT)中至終體積250μL，加入膠條槽，進行等電聚焦，程序為：30V恒壓12 h；1 h內(nèi)線性升壓至200 V；2 h線性升壓至500 V；1 h線性升壓至1000 V；2 h線性升壓至7000 V；7000 V恒壓至36000 V。將其于10 mL平衡液Ⅰ中(50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%甘油、2%SDS和2%DTT)中作用15 min；轉(zhuǎn)入10 mL平衡液Ⅱ(50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%甘油、2%SDS，2.5%Iodineacetamide)中作用15 min。將平衡后的膠條于12.5%SDS-PAGE膠中進行二向電泳；電泳條件為10 mA/膠，1 h后改為20 mA/膠，當溴酚藍移至距分離膠下緣約1 mm時終止電泳。

1.6 蛋白可視化及圖像分析 將凝膠置于10%乙酸中固定2 h，加入約90℃的R350染色液染色2 h，并以10%乙酸進行脫色。在分辨率為300 dpi的條件下使用ImageScanner掃描儀掃描凝膠。采用ImageMaster 2D Platinum version 6.0軟件進行點檢測、編輯、點匹配及數(shù)據(jù)分析。試驗組和對照組各取3只雞的羽髓進行檢測，每個羽髓樣品進行3次重復。分別對4個時期的試驗組和對照組的二維凝膠進行對比并進行t檢驗，其中當?shù)鞍c表達量差異大于2倍時，視為顯著差異表達(上調(diào)或下調(diào))。

1.7 質(zhì)譜(MS)鑒定 采取顯著差異表達蛋白點，由中國科學院上海生化所蛋白質(zhì)組中心進行串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)鑒定。

2 結(jié)果

2.1 羽髓組織蛋白樣品的制備 采用7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲和強力去垢劑CHAPS聯(lián)合使用的組織裂解液，平均每100 mg組織樣品需要0.5 mL裂解液，測得不同批次的羽髓組織蛋白樣品濃度在3.0 μg/μL～4.5 μg/μL 之間，提取的蛋白質(zhì)濃度較穩(wěn)定，表明該蛋白質(zhì)提取方法可靠。

2.2 羽髓蛋白圖譜 采用ImageMaster 2D Platinum軟件進行分析，可分辨的蛋白點約700個，不同樣品間的匹配率大于80%；而2DE方法的分辨率及可重復性均較高。

利用ImageMaster 2D Platinumt軟件對各時期試驗組和對照組圖譜進行數(shù)據(jù)處理和分析，結(jié)果顯示：在MDV感染后4 d檢測到顯著差異表達蛋白點為2個，其中上調(diào)表達為1個，下調(diào)表達為1個；感染后7 d檢測到8個顯著差異表達蛋白點，其中上調(diào)表達為5個，下調(diào)表達為1個；感染后14 d檢測到25個顯著差異表達蛋白點，其中上調(diào)表達為5個，下調(diào)表達為19個，試驗組新增蛋白點1個；感染后21 d檢測到9個顯著差異表達蛋白點，其中上調(diào)表達為7個，下調(diào)表達為2個(圖1)。

圖1 羽髓上皮細胞蛋白圖譜Fig.1 The differentially expressed proteins and correspending to the MS/MS identified protein numbers

2.3 差異蛋白的質(zhì)譜鑒定及分析 本實驗中質(zhì)譜鑒定標準為：蛋白質(zhì)得分在90分以上，并且理論等電點和分子量與該蛋白點在凝膠圖譜中的位置相符。按照該標準，本研究鑒定出29個差異表達蛋白(表1、圖1)

由Uniprot Knowledgebase(Swiss-Prot/TrEMBL)和Gene Ontology等數(shù)據(jù)庫中查找MDV感染后顯著差異表達的29種蛋白質(zhì)的功能，顯示其包括新陳代謝相關(guān)蛋白(25%)、增殖和凋亡相關(guān)蛋白(7%)、細胞骨架蛋白(7%)、信號傳導蛋白(14%)、運輸相關(guān)蛋白(15%)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白(11%）、免疫相關(guān)蛋白(7%)和其他功能蛋白質(zhì)(14%)(圖2)。這些蛋白質(zhì)分別定位于細胞質(zhì)(27%)、過氧化物酶體(6%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(13%)、線粒體(20%)和細胞骨架(6%)，而其余為分泌型蛋白(13%)(圖3)。

圖2 MDV感染后雞羽髓顯著差異表達蛋白的生物學功能分類Fig.2 Analysis of significantly expressed proteins according to their biological process

圖3 MDV感染后雞羽髓顯著差異表達蛋白的細胞內(nèi)定位情況Fig.3 The locates of the significantly expressed proteins in the cellular component

3 討論

MDV是嚴格的細胞結(jié)合病毒，但在羽囊上皮細胞內(nèi)卻可以形成帶囊膜的完整病毒粒子，而其中的病毒通過羽屑釋放到環(huán)境中進行傳播，因此羽髓對于MDV感染性全病毒的復制和MDV的水平傳播具有重要意義。本研究通過2DE方法分析雞感染MDV后各時期羽髓上皮細胞差異表達蛋白的情況，并通過MS技術(shù)鑒定出29種差異表達的蛋白質(zhì)，其中7種為能量代謝相關(guān)蛋白，占鑒定蛋白的25%。另外，檢測結(jié)果顯示，32%的差異表達蛋白定位于細胞質(zhì)，主要與蛋白質(zhì)的加工和轉(zhuǎn)運有關(guān)，可能參與病毒蛋白質(zhì)的翻譯、折疊、組裝和運輸。

實驗結(jié)果表明MDV感染羽髓的前期(1 d～7 d)差異表達的蛋白較少，這可能是由于在感染前期羽髓中的MDV載量較低(103copies/106cells～104copies/106cells)；而在感染后期(14 d～21 d)羽髓中MDV載量上升至感染前期的100倍～1000倍，因此差異表達的蛋白明顯增多[2]。特別是在第14 d(第二次溶細胞感染期)，有21種差異表達蛋白被鑒定出來。而在該階段，宿主細胞受MDV感染影響最大，易感雞的感染往往表現(xiàn)最廣泛和嚴重，在皮膚則會出現(xiàn)顯著的羽囊上皮感染[5-7]。其中，部分差異表達蛋白與Niroshan等對MDV感染雞脾臟差異蛋白質(zhì)組學以及MDV感染易感品系雞和抗性品系雞脾臟差異蛋白質(zhì)組學研究的結(jié)果相符[8-9]；但要了解各蛋白質(zhì)在MDV完整感染性病毒粒子的形成中的作用，則需要對各個蛋白質(zhì)進行深入研究?？傊?，本研究結(jié)果對差異表達蛋白在MDV復制過程中的功能研究具有重要作用，并為進一步研究羽髓中MDV與宿主的相互作用機制及感染性病毒粒子的成熟過程提供依據(jù)。

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