孫佩龍，郝飛飛，呂淑霞，劉新奇，周建華，林躍智

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大動(dòng)物病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001；3.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

組織細(xì)胞受體的表達(dá)及其數(shù)量是決定病毒侵入途徑、擴(kuò)散方式及引起宿主發(fā)病的主要因素，對(duì)病毒受體的研究有助于闡明病毒的侵入機(jī)制，是病毒性疾病的藥物研發(fā)及疫苗研制的重要方面[1]。馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬。由于多數(shù)EIAV感染馬可處于無癥狀期，并且其攜帶馬可以抵抗其它EIAV株的重復(fù)感染，因此EIAV感染馬成為慢病毒感染的天然耐受模型，可以為人類免疫缺陷病毒(HIV)及其他慢病毒致病機(jī)制及疫苗的研究提供依據(jù)[2-4]。

馬傳染性貧血病毒單一受體(Equine lentivirus receptor-1，ELR1)是目前發(fā)現(xiàn)的EIAV的唯一受體。根據(jù)序列特征，歸屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)蛋白超家族[5]。研究表明，單獨(dú)轉(zhuǎn)染表達(dá)ELR1的細(xì)胞就可以介導(dǎo)EIAV病毒的侵入和復(fù)制。由此推測(cè)巨噬細(xì)胞嗜性的EIAV可能僅依賴ELR1侵染靶細(xì)胞[5-6]。這與其他慢病毒包括HIV-1不同[7-8]。本實(shí)驗(yàn)通過昆蟲細(xì)胞表達(dá)可分泌的ELR1胞外區(qū)片段，并獲得蛋白結(jié)晶體，為應(yīng)用X-射線衍射技術(shù)解析蛋白結(jié)構(gòu)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為馬傳染性貧血致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 E.coliTOP10、DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞、真核表達(dá)載體pFastBac HG、昆蟲細(xì)胞株sf9和High Five均由南開大學(xué)劉新奇教授惠贈(zèng)；脂質(zhì)體Cellfectin購(gòu)自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶NheⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Pfu DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自TIANGEN公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、X-gal和dNTP均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Crystal Screen1和Crystal Screen2結(jié)晶試劑盒購(gòu)自Hampton Research公司；Ni-NTA Arg購(gòu)自QIAGEN公司；鼠抗His抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Sigma公司；重組質(zhì)粒pMD-ELR1由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank登錄的ELR1序列(LOC100034069)，利用Oligo 6.0軟件在ELR1胞外區(qū)設(shè)計(jì)引物，上游引物P1：3'-GGCGA ATTCCCCCAGTGCAAAGAGGAG-5'，下游引物P2：3'-GGCAAGCTTTCACACTTCCATCTCAAAGAG-5'。以含有ELR1的重組質(zhì)粒pMD-ELR1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃10 min；94℃ 40 s、55℃ 40 s、72℃ 60 s，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為462 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收。

1.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定 以EcoRⅠ和HindⅢ分別對(duì)PCR產(chǎn)物和pFastBac進(jìn)行酶切后連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac-ELR1，并轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，在含有X-gal和IPTG的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白菌落篩選。將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒命名為Bacmid-ELR1。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與蛋白表達(dá) 采用脂質(zhì)體Cellfectin，將重組質(zhì)粒Bacmid-ELR1轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞sf9中，收集發(fā)生明顯細(xì)胞病變時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)上清，感染High Five細(xì)胞，3 d后離心收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并經(jīng)Amicon Stirred Cell超濾杯進(jìn)行濃縮(含500 mM NaCl的50 mM Tris-HCl，pH8.0替換昆蟲培養(yǎng)基)。10倍稀釋后，將獲得的濃縮上清經(jīng)Ni-NTA柱純化，得到初步純化的ELR1胞外區(qū)蛋白。

1.5 重組ELR1胞外區(qū)蛋白的純化及western blot分析 收集濃度和純度均較高的重組蛋白Ni-NTA柱洗脫液，經(jīng)Superdex 7510/300 GL分子篩層析柱，用 24 mL洗脫液(50mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH8.0)以0.5 mL/min的流速洗脫。分段收集洗脫組分后，進(jìn)行SDS-PAGE和western blot鑒定。其中，一抗為小鼠抗His單克隆抗體(MAb)(1∶1000)，二抗為HRP-山羊抗小鼠IgG(1∶8000)。

1.6 結(jié)晶條件篩選 將純化的ELR1胞外區(qū)蛋白濃縮液脫鹽后，4℃條件下12000 r/min離心10 min，上清進(jìn)行結(jié)晶點(diǎn)樣。應(yīng)用 Crystal Screen1、Crystal Screen2以及Index等共4個(gè)試劑盒194種條件，進(jìn)行坐滴氣相擴(kuò)散法蛋白結(jié)晶條件的篩選。將蛋白樣品與結(jié)晶試劑在結(jié)晶板樣品孔中按照1∶1比例混合點(diǎn)樣，用結(jié)晶透明膠帶封閉于20℃恒溫室中，7 d后顯微鏡觀察坐滴孔，分辨和確認(rèn)蛋白晶體。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增 從重組質(zhì)粒pMD-ELR1中擴(kuò)增ELR1胞外區(qū)片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在約500 bp處呈現(xiàn)單一條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果(462 bp)相符。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac-ELR1經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切后得到4800bp和462 bp的2個(gè)片段，符合預(yù)期結(jié)果。以轉(zhuǎn)染后的重組質(zhì)粒Bacmid-ELR1和陰性對(duì)照質(zhì)粒pFastBac為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到2900 bp和2400 bp的片段，與預(yù)期相符。表明已獲得表達(dá)ELR1胞外區(qū)的桿狀病毒重組質(zhì)粒。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè) 分別將親和層析和凝膠過濾純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)兩種方法處理后獲得純度較高的重組ELR1胞外區(qū)蛋白，在約30 ku處呈現(xiàn)清晰的單一條帶，大小與預(yù)期(26 ku)相符，表明ELR1胞外區(qū)蛋白在桿狀病毒中獲得正確表達(dá)(圖2)。

圖1 ELR1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of ELR1 gene

圖2 純化后ELR1蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified ELR1 protein

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的western blot鑒定 以鼠抗His MAb作為一抗對(duì)純化蛋白進(jìn)行western blot分析，結(jié)果顯示，純化的重組ELR1胞外區(qū)蛋白與小鼠抗His MAb發(fā)生特異性反應(yīng)，在相對(duì)分子質(zhì)量約26 ku處可見一條清晰反應(yīng)帶，表明ELR1胞外區(qū)蛋白在桿狀病毒中獲得正確表達(dá)，并帶有His標(biāo)簽(圖3)。

2.5 ELR1胞外區(qū)蛋白的結(jié)晶 采用坐滴氣相擴(kuò)散法對(duì)純化的ELR1胞外區(qū)蛋白進(jìn)行結(jié)晶試驗(yàn)。通過對(duì)4種篩選試劑盒的194種結(jié)晶條件的初步篩選，在 Crystal Screen2的 31#、39#和 44#，Index的 52#條件下出現(xiàn)微晶，通過對(duì)結(jié)晶條件的分析進(jìn)一步確定Crystal Screen2的31#和44#的晶體為蛋白晶體(圖 4)。

圖3 重組ELR1的western blot檢測(cè)Fig.3 Western blot analysis of the recombinant ELR1

圖4 ELR1的蛋白晶體Fig.4 Protein crystals of ELR1

3 討論

前期研究顯示ELR1胞外區(qū)蛋白在E.coli中以包涵體形式表達(dá)，不具備生物活性[9]。桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，與E.coli表達(dá)系統(tǒng)相比，其具有表達(dá)量大、具有較完善的翻譯后修飾與加工體系、有利于保持外源蛋白的生物活性等優(yōu)點(diǎn)[10]。本研究構(gòu)建了ELR1基因主要功能片段的昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒，并進(jìn)行ELR1胞外區(qū)蛋白的可溶性表達(dá)。重組蛋白表達(dá)時(shí)分泌到昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中，簡(jiǎn)化了后期的純化工作，有利于大規(guī)模獲得具有天然活性的ELR1胞外區(qū)蛋白。

對(duì)病毒受體晶體結(jié)構(gòu)的解析是研究受體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能以及研究抗病毒藥物的重要手段，而選擇正確的蛋白表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于蛋白質(zhì)的結(jié)晶及其重要。本研究采用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ELR1的主要功能區(qū)域，通過優(yōu)化結(jié)晶條件，獲得重組ELR1胞外區(qū)蛋白結(jié)晶。根據(jù)該晶體的形狀可以判斷，其適合后續(xù)X-射線衍射，但晶體體積偏小，未達(dá)到衍射標(biāo)準(zhǔn)，不能夠進(jìn)行衍射試驗(yàn)。后續(xù)工作將通過提高蛋白的濃度、純度和改變結(jié)晶溫度，篩選出適合衍射的蛋白晶體，采用X-射線衍射技術(shù)解析蛋白結(jié)構(gòu)，為研究EIAV的感染機(jī)理提供試驗(yàn)依據(jù)。

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