陳曉妹，王 飛，張 翼，劉麗玲，田國(guó)斌，曾顯營(yíng)，管雪婷，程 成，陳化蘭，李雁冰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)的感染和/或疾病綜合征[1]，AI病毒(AIV)亞型眾多，其中H9N2亞型AIV在我國(guó)家禽中廣泛存在[2]，雖然該亞型病毒致病力低，但臨床上常與大腸桿菌和支原體等混合感染，影響家禽的產(chǎn)蛋率，同時(shí)給養(yǎng)禽業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。相關(guān)文獻(xiàn)顯示H9N2亞型AIV能夠感染人類，使得H9N2亞型AIV具有比較重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[3-6]。

診斷和疫苗接種是AI防制的關(guān)鍵[7]。血凝-血凝抑制(HA-HI)試驗(yàn)是AI診斷的常用方法，也是病毒抗原性差異分析的常用方法[8]，而病毒抗原性差異分析是篩選疫苗株的常用方法。特異性血清是HA-HI試驗(yàn)的必備條件。本實(shí)驗(yàn)從1996年～2008年我國(guó)流行的不同亞群的H9N2亞型AIV中篩選6株代表病毒株，將其血凝素(HA)基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后，分別克隆到pCAGGS載體中[9-10]，以重組質(zhì)粒免疫SPF雞，制備特異性的抗血清，為臨床診斷和病毒抗原性差異分析提供特異性H9亞型AIV HA單因子血清。

1 材料和方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒和血清 6株代表病毒株分別為：CK/HuN/33/08(HuN33/08)、CK/HuNHS/1/06(HuNHS1/06)、DK/GX/10/05(GX10/05)、SH10/01(DQ064378.1)、HLJ135/00(DQ064366.1)和 SD6/96(DQ064376.1)，HA序列由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室測(cè)序保存；將H9亞型AIV的HA基因用雞偏嗜的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的序列由南京金斯特公司人工合成；真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS由農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室保存；針對(duì)H9亞型AIV的HI陽(yáng)性血清及293 T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；JM109菌株感受態(tài)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；FITC標(biāo)記的兔抗雞熒光抗體購(gòu)自KPL公司；Lipofectamine2000TM試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DMEM和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司。

1.3 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及大量制備 將合成序列和pCAGGS以EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，用連接酶將兩者相連。重組質(zhì)粒以EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鑒定。在JM109中擴(kuò)增重組質(zhì)粒，SDS-堿裂解法抽提重組質(zhì)粒，并以聚乙二醇法純化。

1.4 真核表達(dá)重組質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞內(nèi)，48 h后進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。間接免疫熒光試驗(yàn)的一抗為H9亞型AIV的HI陽(yáng)性血清，二抗為FITC標(biāo)記的兔抗雞熒光抗體，同時(shí)分別設(shè)置一抗為陰性血清的陰性對(duì)照和轉(zhuǎn)染pCAGGS的293T細(xì)胞陰性對(duì)照。熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.5 H9亞型AIV抗血清的制備 將24只1月齡SPF雞分為6組，每組4只。每只腿肌注射200 μg(1 μg/μL)重組質(zhì)粒。

免疫后每周采血，HI試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)，待效價(jià)達(dá)到峰值時(shí)心臟采血收獲血清。

1.6 敏感性試驗(yàn) 將收獲的血清與同源抗原、H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)血清和抗原進(jìn)行交叉HA-HI試驗(yàn)，檢測(cè)其靈敏度。

1.7 特異性試驗(yàn) 將收獲血清及H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)血清與H1～H16亞型AIV抗原、新城疫病毒(NDV)抗原交叉進(jìn)行HA-HI試驗(yàn)，檢測(cè)血清特異性。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其酶切分析 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切獲得1700 bp和4700 bp兩個(gè)片段，1700 bp片段與HA基因長(zhǎng)度相符。測(cè)序結(jié)果表明HA基因正確插入pCAGGS載體(圖1)。

圖1 真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCAGG-HA的酶切鑒定Fig.1 Identification of pCAGG-HA by restrictive enzyme digestion

2.2 真核表達(dá)重組質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)間接免疫熒光染色，表達(dá)的HA蛋白產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞膜上，并在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出特殊的熒光。構(gòu)建的6種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞均可見(jiàn)特異的熒光表達(dá)產(chǎn)物，6種重組質(zhì)粒均能表達(dá)，一抗為陰性血清的陰性對(duì)照及轉(zhuǎn)染pCAGGS的293T細(xì)胞陰性對(duì)照均為陰性(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的間接免疫熒光結(jié)果Fig.2 Indirect immunofluorescence assay of 293T cells transfected with recombinant plasmid

2.3 H9亞型AIV抗血清敏感性試驗(yàn)結(jié)果 SPF雞免疫后第6周，抗體水平達(dá)到峰值，心臟采血收獲血清。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，除GX10/05及SH10/01血清，其他各血清對(duì)其HA同源的抗原HI效價(jià)均為最高。GX10/05血清對(duì)HuNHS1/06抗原HI效價(jià)最高；SH10/01血清對(duì)SD6/96抗原HI效價(jià)最高；HLJ135/00血清對(duì)SH10/01及GX10/05抗原沒(méi)有HI作用；SH10/01血清對(duì)HLJ135/00抗原也沒(méi)有HI作用；H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)HLJ135/00抗原HI效價(jià)低，對(duì)其他抗原HI效價(jià)均較高。HLJ135/00血清對(duì)H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)抗原無(wú)HI作用(表1)。

表1 血清與H9亞型AIV抗原血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The HI test of the antiserum with antigen of H9 subtype AIV

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，單因子血清對(duì)H1-H16亞型AIV抗原及NDV抗原無(wú)HI作用；H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)H7亞型AIV抗原HI效價(jià)為 2 log2；HLJ135/00、HuN33/08、HuNHS1/06、SH10/01、GX10/05和SD6/96單因子血清對(duì)H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)抗原的HI效價(jià)分別為0 log2、7 log2、8 log2、8 log2、8 log2和8 log2。H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)抗原的HI效價(jià)為11 log2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選取1996年～2008年間分離自H9N2亞型AIV不同亞群的6株代表病毒株，將其HA基因經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后，構(gòu)建表達(dá)HA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒免疫雞，制備只含有HA抗體的單因子血清。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除SH10/01以外的單因子血清對(duì)其同源抗原的HI效價(jià)均高于或等于標(biāo)準(zhǔn)血清，表明H9亞型AIV單因子血清的敏感性高于標(biāo)準(zhǔn)血清；H9亞型AIV單因子血清與其他亞型AIV抗原及NDV抗原無(wú)交互，而標(biāo)準(zhǔn)血清與H7亞型AIV抗原有交互，表明H9亞型AIV單因子血清的特異性強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)血清。由于H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)血清由H9N2亞型滅活全病毒制備，血清中含有病毒的多種蛋白抗體，其中神經(jīng)氨酸酶(NA)抗體的空間位阻效應(yīng)會(huì)產(chǎn)生非特異的HI作用[11]，因此產(chǎn)生交互現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中使用的病毒株，根據(jù)其HA基因型分類，CK/SH/10/01(H9N2)、DK/GX/10/05(H9N2)和 CK/SD/6/96(H9N2)均為BJ/1/94類病毒，抗原差異很小，因此制備的單因子血清抗體滴度相近；而HLJ135/00為TY/WI/66類病毒，與其他病毒抗原差異大，制備的單因子血清對(duì)其他抗原的抗體滴度低[12]。實(shí)驗(yàn)中測(cè)試抗原相同時(shí)，單因子血清的抗體滴度低于標(biāo)準(zhǔn)血清，由于單因子血清是由重組質(zhì)粒單次免疫后制備的，而標(biāo)準(zhǔn)血清是由滅活全病毒多次免疫后制備的，導(dǎo)致單因子血清抗體滴度低于標(biāo)準(zhǔn)血清。

制備單因子血清用真核表達(dá)重組質(zhì)粒免疫雞，不用接觸和處理活病毒，安全性更高。單因子血清中只含有HA的抗體，避免了NA抗體產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)對(duì)HI試驗(yàn)結(jié)果的影響。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了6株H9N2亞型AIV的HA基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并用重組質(zhì)粒免疫SPF雞制備了單因子血清。該血清與全病毒血清相比敏感性好、特異性強(qiáng)、可用于臨床診斷及實(shí)驗(yàn)研究。

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