彭 凌，朱必鳳，楊旭夫，劉博婷，韋昭玉

(韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)能夠?qū)е虏∝i發(fā)生以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎為特征的綜合征，又稱為革拉瑟氏病(Glasser's disease)。該病于1910年由Glasser首次報(bào)道。目前，國際上將HPS菌株分為15個(gè)血清型。研究表明，不同血清型菌株之間的交叉免疫保護(hù)力不強(qiáng)，或者無交叉保護(hù)作用，而且約15%～41%的分離株不能夠以現(xiàn)有的血清分型方法進(jìn)行鑒定，給免疫防治造成很大困難[1-3]。

對于HPS的研究除血清分型外還常采用酶切指紋圖譜(REF)、多位點(diǎn)酶電泳分析(MLEE)和腸桿菌科基因間重復(fù)一致序列PCR(Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR，ERIC-PCR)等方法進(jìn)行HPS基因的分型。但前兩種方法耗時(shí)、操作復(fù)雜，并且成本高。2000年Rafiee等將ERIC-PCR用于HPS分型中，顯示不同血清型的標(biāo)準(zhǔn)菌株具有不同的指紋圖譜，具有良好的多態(tài)性，該技術(shù)可以用于該菌感染的流行病學(xué)研究，有利于鑒定主要流行菌株及其進(jìn)化關(guān)系[4]。

外膜蛋白(OMP)是革蘭氏陰性細(xì)菌的表型標(biāo)志，菌株不同，則OMP型不同；在血清學(xué)分型復(fù)雜的情況下，OMP是用于追蹤流行株的工具[5]。OMP分型僅涉及OMP的提取和SDS-PAGE分析，具有快速、低消耗的特點(diǎn)，如果把OMP分析應(yīng)用于HPS的分型可以在一定程度上輔助ERIC-PCR分型的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)在對HPS分離鑒定的基礎(chǔ)上，對不能定型的野外分離株采用ERIC-PCR分型和OMP分型技術(shù)研究不同豬場的HPS流行復(fù)雜程度及差異，并應(yīng)用于HPS感染的流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料和方法

1.1 菌株24個(gè)HPS分離株為本實(shí)驗(yàn)室按照文獻(xiàn)[6]方法由3個(gè)發(fā)病豬場發(fā)病豬的上呼吸道或病變組織中分離并鑒定，分別為江西(J豬場)J1～J88個(gè)分離株；廣東(G豬場)G1～G99個(gè)分離株；上海(S豬場)S1～S77個(gè)分離株；HPS標(biāo)準(zhǔn)菌株H555株、胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)S3-4株、支氣管敗血波氏桿菌(B.bronchiseptica)X362株、金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923株和大腸埃希氏菌(E.coli)ATCC25922株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 PCR鑒定 參照文獻(xiàn)[7]合成引物：HP1F3：5'-TATCGGGAGATGAAAGAC-3'、HP2F2：5'-GTAAT GTCTAAGGACTAG-3'和 HRex：5'-CCTCGCGGCTT CGTC-3'，預(yù)擴(kuò)增片段大小為1090 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用凍融法提取細(xì)菌DNA。

PCR 反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL、MgCl21.5 μL、引物 HP1F31 uL、引物 HP2F21 μL、引物HRex 1 μL、模板 DNA 3 μL、4×dNTPs 0.4 μL、TaqDNA聚合酶0.4 μL、無菌去離子水14.2 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 1 min、56℃ 45 s、72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，利用Master VDS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相。

1.3 ERIC-PCR分型 按照文獻(xiàn)[4]報(bào)道的引物序列(ERIC-1R：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'和 ERIC-2R：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3')，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用酚氯仿法抽提細(xì)菌DNA[8]，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25 μL)為：10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、10 mmol/L KCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTP、引物各100 ng、基因組DNA 100 ng、TaqDNA聚合酶1.5 U。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2 min；94℃30 s、50℃ 30 s、72℃ 6 min， 35個(gè)循環(huán)； 72℃ 6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用Master VDS凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.4 OMP的SDS-PAGE檢測 OMP的提取參照文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行，并采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定 對24個(gè)HPS分離株的PCR鑒定結(jié)果表明，24個(gè)分離株和陽性對照均能夠擴(kuò)增出預(yù)期的1090 bp的條帶，而陰性對照、A.pleuropneumoniae、B.bronchiseptica、S.aureus和 E.coli均未擴(kuò)增出特定條帶(圖1)。

2.2 ERIC-PCR指紋圖譜 對24個(gè)HPS分離株進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增，得到具有高重復(fù)性、清晰的電泳圖譜。結(jié)果表明：PCR產(chǎn)物大小約為500 bp～3000 bp之間，表現(xiàn)出良好的DNA多態(tài)性，各分離株均擴(kuò)增3條～7條帶，最大約3000bp，最小約500bp(圖2)。各分離株間指紋圖譜表現(xiàn)出一定程度的相同或差異。根據(jù)每個(gè)分離株擴(kuò)增產(chǎn)物中分子量不同的DNA條帶的差異，24株分離株可以直觀分為10種指紋圖譜。圖譜Ⅰ包含5個(gè)分離株：J1、J3、J4、J5和J8；圖譜Ⅱ包含3個(gè)分離株：J2、J6和J7；圖譜Ⅲ為1株G1；圖譜Ⅳ包含7株：G2、G3、G4、G6、G7、G8和G9；圖譜Ⅴ僅1個(gè)分離株G5；圖譜Ⅵ包含2個(gè)分離株：S1和S4；圖譜Ⅶ為1個(gè)分離株S2；圖譜Ⅷ為1個(gè)分離株S3；圖譜Ⅸ包含2個(gè)分離株：S5和S6；圖譜Ⅹ為1個(gè)分離株S7。J豬場存在圖譜Ⅰ和Ⅱ包含的8個(gè)HPS分離株；G豬場存在圖譜Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ包含的9個(gè)HPS分離株；S豬場存在圖譜Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ包含的7個(gè)HPS分離株。表明同一豬場流行多種基因型，并且不同豬場流行基因型不同。

2.3 OMP圖譜 提取24個(gè)HPS分離株的OMP進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示：每個(gè)分離株存在8條或8條以上蛋白條帶，分子量為17 ku～120 ku之間，主要位于30 ku～43 ku之間，每個(gè)分離株在36.6 ku～38.5 ku之間均存在一條蛋白量較大的條帶。表明各豬場流行的菌株及其流行的復(fù)雜程度存在差異。根據(jù)每個(gè)分離株OMP的分子量大小和濃度的差異，24株分離株可直觀分為10種OMP圖譜(圖3)，該結(jié)果與ERIC-PCR分析結(jié)果一致。

為驗(yàn)證OMP的重復(fù)性，本研究對分離株進(jìn)行4次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示同一分離株產(chǎn)生的OMP圖譜相同，具有較好的重復(fù)性。

圖1 HPS分離株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Identification of H.parasuisisolates by PCR

圖2 24株HPS分離株ERIC指紋圖譜Fig.2 ERIC-PCR fingerprints(Ⅰ-Ⅹ)of 24H.parasuisisolates

圖3 24株HPS的外膜蛋白圖譜Fig.3 OMP patterns(Ⅰ-Ⅹ)of 24H.parasuisisolates

3 討論

為確定江西、廣東、上海3個(gè)發(fā)病豬場HPS病的流行情況，本研究對由發(fā)病豬群分離鑒定的24個(gè)HPS菌株進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增得到特異性條帶，從分子生物學(xué)水平驗(yàn)證了HPS常規(guī)鑒定的準(zhǔn)確性。并且采用ERIC-PCR指紋圖譜分型和OMP分型技術(shù)對24個(gè)分離株進(jìn)行分型，結(jié)果顯示兩種方法均表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，兩種方法的結(jié)果在本研究中也表現(xiàn)出一致性。本研究結(jié)果與Ruiz的研究結(jié)果有所不同[10]，而本研究結(jié)果表明各豬場HPS流行情況復(fù)雜，同一豬場存在多種基因型，并且不同豬場流行的基因型也不一致。ERIC-PCR分型技術(shù)已被國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用于HPS的分型鑒定及流行病學(xué)研究[4,11-12]，本研究也進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。另外，本實(shí)驗(yàn)顯示OMP與ERIC-PCR分型方法均表現(xiàn)出遺傳變異多樣性，表明HPS的ERIC-PCR指紋圖譜和OMP圖譜均能夠反映HPS分離株的遺傳相關(guān)性，因此OMP分型技術(shù)應(yīng)用于該菌的分型是可行的。

本研究中兩種分型方法結(jié)果均表明24個(gè)野外分離株共得到10種圖譜，即10種菌株：J豬場2種、G豬場3種、S豬場有5種。各豬場HPS流行的復(fù)雜程度不一致，雖然在同時(shí)期感染發(fā)病，但流行菌株存在地域性差異，因此造成疫苗免疫效果的差異。在商品化疫苗無效的情況下，可以考慮使用本豬場的分離株制備疫苗，但一個(gè)豬場可能存在多種菌株，傳統(tǒng)方法采用血清分型進(jìn)行菌株的選擇，但該方法耗時(shí)費(fèi)力，并且臨床上有約15%～41%的分離株不能以現(xiàn)有的血清分型方法進(jìn)行鑒定。因此，在無標(biāo)準(zhǔn)分型血清或用標(biāo)準(zhǔn)分型血清無法正確分型的情況下，采用ERIC-PCR和OMP分型技術(shù)對野外分離株進(jìn)行基因分型和表型分型鑒定，可以為HPS的免疫預(yù)防提供參考。如本研究J豬場雖然分離到8個(gè)菌株，但通過分析表明僅存在2種圖譜，即2個(gè)基因型菌株，因此制備疫苗時(shí)只需考慮該兩種菌株。

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