楊黎，朱霞，常建英，冉立（貴州省腫瘤醫(yī)院乳腺婦瘤科，貴陽(yáng)市 550000）

細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的失衡導(dǎo)致細(xì)胞分化、凋亡的變化，從而腫瘤細(xì)胞不斷增殖形成了侵襲、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。研究細(xì)胞增殖、凋亡中的一系列分子事件變化，并結(jié)合臨床預(yù)后因素，可能將直接地指導(dǎo)腫瘤的診斷，確定個(gè)體化治療手段以及揭示腫瘤預(yù)后的內(nèi)在生物學(xué)特征。本文檢測(cè)原癌基因人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）、細(xì)胞增殖標(biāo)志物增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax在乳腺癌組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理因素的關(guān)系，探討HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表達(dá)作為判斷乳腺癌生物學(xué)行為和預(yù)后指標(biāo)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

50例乳腺癌根治術(shù)后標(biāo)本來(lái)自我院1997年收治的HE染色病理確診的女性患者，所有病例術(shù)前未接受化療和放療。標(biāo)本用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋為存檔蠟塊。患者年齡31～68歲，中位年齡45歲；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌46例，浸潤(rùn)小葉癌2例，粘液癌1例，印戒細(xì)胞癌1例；腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例；臨床分期Ⅰ期2例，Ⅱ期32例，Ⅲ期14例，Ⅳ期2例。

1.2 試劑

HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax蛋白的檢測(cè)一抗均為鼠抗人單克隆抗體；免疫組化Envision二步法試劑盒，購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化方法

存檔蠟塊連續(xù)切片，脫蠟再浸泡于梯度乙醇水化；3%過(guò)氧化氫孵育，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；微波抗原熱修復(fù)；滴加一抗，37℃孵育1～2 h，TBS沖洗；滴加非免疫性血清，37℃孵育20 min，TBS沖洗；滴加Envision二抗，37℃孵育20～30 min，TBS沖洗；顯色，沖洗、復(fù)染、脫水、封片。

1.4 結(jié)果判斷

HER-2陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜，呈棕黃色染色，按Hercep Test標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[1]。0級(jí):浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞無(wú)染色；1級(jí):任何比例浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞呈弱且不完整的細(xì)胞膜染色或少于10%的腫瘤細(xì)胞呈弱且完整的細(xì)胞膜染色；2級(jí):大于10%的腫瘤細(xì)胞呈弱或不一致的完整的細(xì)胞膜染色或小于30%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜染色；3級(jí):大于30%的浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞呈強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜染色。評(píng)估其蛋白表達(dá)狀況為:0級(jí)、1級(jí)為陰性，2級(jí)為不確定，3級(jí)為陽(yáng)性。PCNA陽(yáng)性染色位于細(xì)胞核，Bcl-2陽(yáng)性染色位于細(xì)胞漿，Bax陽(yáng)性染色位于細(xì)胞漿。陽(yáng)性細(xì)胞染色為棕黃色或棕褐色，評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為:“－”為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；“+”為＜25%陽(yáng)性細(xì)胞；“++”為25%～50%陽(yáng)性細(xì)胞；“+++”為＞50%陽(yáng)性細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)、校正的χ2檢驗(yàn)或確切概率法，各指標(biāo)的相關(guān)分析用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

乳腺癌組織中HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax的表達(dá)見(jiàn)圖1，其中HER-2表達(dá)率為44%（22/50），PCNA表達(dá)率為82%（41/50），Bcl-2表達(dá)率為48%（24/50），Bax表達(dá)率為54%（27/50）。

圖1 HER-2（A）、PCNA（B）、Bcl-2（C）、Bax（D）在乳腺癌組織中的表達(dá)（Envision×200）Fig 1 The expression of HER-2（A），PCNA（B），Bcl-2（C），and Bax（D）in breast cancer tissue（Envision ×200）

2.2 乳腺癌HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系

因50例乳腺癌病理類型中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌占絕大多數(shù)，其他類型例數(shù)少，故未作統(tǒng)計(jì)分析。Ⅰ、Ⅳ期病例各2例，故將Ⅰ、Ⅱ期合并，Ⅲ、Ⅳ期合并。乳腺癌組織中HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和臨床分期的關(guān)系如表1所示。

表1 HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系Tab 1 Relation between HER-2，PCNA，Bcl-2 and Bax expression and clinicopathological factors

HER-2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率為57.1%，高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的27.3%（P＜0.05）；在Ⅲ～Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)率為62.5%，高于Ⅰ～Ⅱ期的35.3%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但卡方值接近臨界值，在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)可有趨向性。

PCNA與腫瘤大小明顯相關(guān)，在腫瘤直徑≥4 cm的患者中陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)96.6%，在＜4 cm組陽(yáng)性表達(dá)率為61.9%（P＜0.01）。

Bcl-2與年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無(wú)關(guān)。

Bax在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率為67.9%，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為36.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在Ⅲ～Ⅳ期組的陽(yáng)性表達(dá)率為75.0%，高于Ⅰ～Ⅱ期組的44.1%（P＜0.05）。

2.3 乳腺癌HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況的相關(guān)分析

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)性檢驗(yàn)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的指標(biāo)有HER-2、Bax，且呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)均為0.284，P＜0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了上面的結(jié)果；Bcl-2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)系數(shù)為負(fù)值，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

HER-2是一種原癌基因，編碼P185跨膜蛋白，是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員之一，具有酪氨酸激酶活性，激活后可傳導(dǎo)致分裂信號(hào)。HER-2癌基因的激活方式表現(xiàn)為基因擴(kuò)增與蛋白過(guò)表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道[2，3]，免疫組化技術(shù)（IHC）檢測(cè)HER-2表達(dá)率在10%～54%之間。采用IHC與直接基因檢測(cè)水平的熒光原位雜交（FISH）方法相比，檢測(cè)符合率達(dá)96%[4]。本課題采用臨床最常用的IHC檢測(cè)HER-2基因在細(xì)胞表面的蛋白表達(dá)水平，其表達(dá)率為44%。大多數(shù)研究已表明[5，6]，HER-2的改變與乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)，HER-2陽(yáng)性者腫瘤的惡性程度較高、激素受體水平較低、腫瘤較大、多有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、總生存期較短，而且一旦病情復(fù)發(fā)，HER-2陽(yáng)性者對(duì)激素和化療的反應(yīng)率均很低，因而HER-2又可作為對(duì)激素或化療有否反應(yīng)的預(yù)示指標(biāo)。HER-2表達(dá)增高與臨床病理因素關(guān)系的研究較多，但結(jié)果不盡一致。在本研究中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中HER-2表達(dá)率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例，相關(guān)分析亦提示HER-2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；另外，臨床分期晚的病例顯示出HER-2表達(dá)率高的傾向性。專門針對(duì)HER-2陽(yáng)性乳腺癌的分子靶向藥物——曲妥珠單抗，就是以腫瘤細(xì)胞表面的HER-2為靶點(diǎn)，通過(guò)阻斷HER-2引導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。目前美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)（NCCN）和中國(guó)版cNCCN指南已將其推薦為HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。與傳統(tǒng)化療相比較，曲妥珠單抗只靶向作用于腫瘤細(xì)胞而避免殺傷正常細(xì)胞，因此不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的惡心、嘔吐、貧血、脫發(fā)等不良反應(yīng)。

PCNA又稱周期蛋白，是DNA聚合酶的輔助蛋白，作用于DNA合成過(guò)程，特別是G1晚期與S期，是判定細(xì)胞增殖活性的內(nèi)源性標(biāo)志物，已證實(shí)PCNA的合成和表達(dá)與細(xì)胞增殖狀態(tài)相關(guān)，即PCNA表達(dá)越高，細(xì)胞增生越活躍[7]。研究表明，PCNA與乳腺癌的分期、療效、預(yù)后有密切的關(guān)系[8，9]。本組資料PCNA的表達(dá)率為82%，PCNA表達(dá)者腫瘤組織體積較大。PCNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期晚的病例中有高表達(dá)的趨勢(shì)，但無(wú)明顯差異性。分析原因，一是本組病例數(shù)較少，可能沒(méi)有很好地反映PCNA與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性；二是可能PCNA只代表腫瘤細(xì)胞增殖活性而不代表腫瘤組織的侵襲性。因此，PCNA與乳腺癌轉(zhuǎn)移是否有關(guān)，仍需作進(jìn)一步的研究。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅取決于細(xì)胞的增殖率，也取決于細(xì)胞的凋亡率。Bcl-2和Bax已知是一對(duì)作用相反的凋亡抑制基因和促進(jìn)基因，Bcl-2基因表達(dá)往往與好的生物學(xué)特性相關(guān)[10，11]。本組資料以往的研究結(jié)果顯示[12]，通過(guò)多因素COX模型分析Bcl-2可作為判斷乳腺癌生存期長(zhǎng)短的指標(biāo)，Bcl-2表達(dá)預(yù)示患者生存期較長(zhǎng)。然而，在本研究中Bcl-2與腫瘤大小、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素均無(wú)關(guān)，這可能是單因素分析中未控制其他因素對(duì)乳腺癌原發(fā)灶大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，故未體現(xiàn)Bcl-2表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究顯示，Bax表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期晚有關(guān)，表明了Bax與不良的生物學(xué)特性相關(guān)，結(jié)論與當(dāng)前的多數(shù)研究一致[13]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，從基因水平探討乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。臨床上早期將具有高危因素及潛在轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)的乳腺癌患者篩選出來(lái)，進(jìn)行針對(duì)性的治療是提高乳腺癌生存率、減少?gòu)?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明，HER-2、PCNA、Bcl-2、Bax可作為判斷乳腺癌預(yù)后的可靠指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)預(yù)后因子，全面判斷患者的預(yù)后，早期篩選出具有高危因素的患者，給予積極治療，將在很大程度上提高患者的術(shù)后生存率。

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