郭鋒偉， 趙志輝， 楊盛力， 袁祖成， 薛 磊

乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是一種多功能蛋白，其與肝炎及肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。HBx同細(xì)胞凋亡的關(guān)系很復(fù)雜，有些研究者認(rèn)為HBx可抑制肝細(xì)胞凋亡［1-2］，促進(jìn)肝細(xì)胞增生;而其他研究者得出的結(jié)論是HBx可促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡［3-4］。同時，HBx和肝癌多藥耐藥關(guān)系密切，其可通過激活NF-κB信號通路上調(diào)P-gp的表達(dá)［5］。PDCD5是由北京大學(xué)人類疾病基因研究中心克隆成功的新的凋亡相關(guān)蛋白，國際人類基因命名委員會將其命名為程序化細(xì)胞死亡因子5(programmed cell death 5，PDCD5)［6］，是一種重要的凋亡正調(diào)節(jié)因子，研究表明其在肝癌中低表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并可能是導(dǎo)致肝癌多藥耐藥的原因之一［7］。HBx和PDCD5都和肝癌發(fā)生及凋亡關(guān)系密切，兩者之間的關(guān)系目前國內(nèi)外尚未見報到，為此我們進(jìn)行了以下研究。

1 資料和方法

1.1 資料和試劑 鼠抗人HBx單克隆抗體購于CHEMICON公司;鼠抗人PDCD5單克隆抗體(濃度為0.5 g/L)由北京大學(xué)人類疾病基因中心陳英玉教授惠贈;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑 lipofectamine 2000，G418為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;DMEM、胎牛血清購于美國Hyclone公司;PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;正常人肝細(xì)胞L02購自中國典型物種保藏中心，pcDNA3.1-HBx為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 穩(wěn)定表達(dá)乙型肝炎病毒X蛋白的L02細(xì)胞系的建立與鑒定 將L02細(xì)胞接種于24孔板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長至60%～80%后融合。按照試劑說明書將pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞消化，分布在24孔板中，用含500 mg/L G418的培養(yǎng)液篩選20 d，得到單克隆細(xì)胞，再改用含250 mg/L G418的培養(yǎng)液維持至傳代，備份。得到的細(xì)胞系命名為L02/HBx細(xì)胞系和L02/pcDNA3.1細(xì)胞系。通過RT-PCR和Western Blot進(jìn)行鑒定，HBx引物序列:上游為 5'-TCCTTTGTTTACGTCCCGTC-3'，下 游 為 5'-TGCCTACAGCCTCCTAATAC-3'。內(nèi)參照β-actin引物序列:上游為5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3'，下 游 為 5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3'。鼠抗人HBx單克隆抗體稀釋度 1∶500，二抗稀釋度 1∶4 000，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。

1.3 Real-time PCR 技術(shù)檢測 L02/pcDNA3.1 和L02/HBx細(xì)胞中PDCD5 mRNA的表達(dá) 收獲培養(yǎng)液中的L02/pcDNA3.1細(xì)胞L02/HBx細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA的濃度和純度，取相同量的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，每組cDNA均以基因引物加熒光染料復(fù)合物sybrGreen Mix(2×)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，每個反應(yīng)做3個復(fù)孔。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋5倍為模板。PDCD5引物序列:上游為5'-ACCCAAGTTCTGGATCAGTCG-3'，下 游 為 5'-AGTTGTCCATATCTTGCCATCTG-3'。內(nèi)參照β-actin引物序列:上游為5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'，下游為 5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'?？偡磻?yīng)體系共 25 μL:sybrGreen Mix 12.5 μL，cDNA 模板2 μL，10 μM 上游引物和 10 μM 下游引物各 1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件:95℃變性 2 min，40 次循環(huán)內(nèi)95℃變性15 s，60℃退火 15 s，72℃延伸 45 s，72℃再延伸10 min，重復(fù)3次。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測L02/pcDNA 3.1和L02/HBx細(xì)胞中PDCD5蛋白的表達(dá) 收獲培養(yǎng)液中的2種細(xì)胞，用三去污裂解法提取細(xì)胞總蛋白，所得總蛋白經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，PDCD5一抗稀釋度1∶500，二抗稀釋度1∶3 000，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，計算機(jī)掃描蛋白質(zhì)條帶并作灰度分析。以β-actin作內(nèi)參照，PDCD5/β-actin(灰度值的比值)代表 PDCD5蛋白相對表達(dá)水平，每個樣本重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用t檢驗(yàn)或方差分析，計數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙型肝炎病毒X蛋白的L02細(xì)胞系的建立通過PCR和Western Blot可以檢測到L02/HBx中有HBx mRNA(圖1)和蛋白(圖2)的表達(dá)，對照組細(xì)胞中未見表達(dá)。

圖1 HBx mRNA轉(zhuǎn)染圖M:markers(最亮的條帶為400 bp);A:對照細(xì)胞;B:轉(zhuǎn)染細(xì)胞

圖2 Western blot檢測對照細(xì)胞和L02/HBx細(xì)胞中HBx蛋白的表達(dá)1:L02/pcDNA3.1細(xì)胞;2:L02/HBx細(xì)胞

2.2 Real-time PCR 技術(shù)檢測 L02/pcDNA3.1 和L02/HBx細(xì)胞中PDCD5 mRNA的表達(dá)情況 Realtime PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBx基因后，L02/HBx細(xì)胞中PDCD5 mRNA表達(dá)水平明顯增加，與 L02/pcDNA3.1細(xì)胞相比，為其 1.95 ±0.13 倍(n=3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 Real-time PCR檢測L02/pcDNA3.1和L02/HBx細(xì)胞中PDCD5 mRNA的表達(dá)

2.3 蛋白印跡法檢測L02/pcDNA3.1和L02/HBx細(xì)胞中PDCD5蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBx基因后，L02/HBx細(xì)胞中PDCD5蛋白表達(dá)水平明顯降低，與L02/pcDNA3.1細(xì)胞相比，為其1.84±0.25倍(n=3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖4。

圖4 Western blot檢測L02/pcDNA3.1細(xì)胞和L02/HBx細(xì)胞中PDCD5蛋白的表達(dá)1:L02/pcDNA3.1 細(xì)胞;2:L02/HBx細(xì)胞

3 討論

乙肝病毒X蛋白通過直接作用和信號通路2種途徑，廣泛激活病毒與細(xì)胞的啟動子，參與多種基因的調(diào)控，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥關(guān)系密切。而HBx同肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系極為復(fù)雜，部分研究顯示HBx抑制肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞增生，部分研究結(jié)果顯示HBx促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡。推測不同的結(jié)果可能與HBV感染的不同階段以及HBx自身表達(dá)量有關(guān)，也可能是不同實(shí)驗(yàn)所用的刺激因子和細(xì)胞類型不同等因素所致，亦或HBx本身對凋亡具有雙重調(diào)節(jié)作用。

TFAR19(TF-1 cell apoptosis-related gene 19)是北京大學(xué)人類疾病基因研究中心馬大龍教授從人白血病細(xì)胞株TF-1細(xì)胞中克隆得到的新凋亡相關(guān)基因，國際人類基因命名委員會建議命名為PDCD5(programmed cell death 5)，是我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的新功能基因［8］。研究發(fā)現(xiàn)PDCD5能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和抑制細(xì)胞生長，在細(xì)胞凋亡的早期高表達(dá)并能快速核轉(zhuǎn)位，早于細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)的外翻和細(xì)胞核內(nèi)DNA片段化，與凋亡早期核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能紊亂密切相關(guān)［8］。腺病毒介導(dǎo)的PDCD5基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)了依托泊苷誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡［9］，PDCD5單克隆抗體導(dǎo)入HeLa細(xì)胞，可以抑制由足葉乙苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［10］，這些都說明PDCD5在細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著重要作用。

本研究顯示在L02細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBx基因后PDCD5表達(dá)上調(diào)，一定程度上促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，但不能就此推導(dǎo)出HBx促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，因?yàn)槲覀兦捌诘牧硪豁?xiàng)研究表明(也在該細(xì)胞系中進(jìn)行)HBx也可以上調(diào)凋亡抑制蛋白Livin的表達(dá)［11］。由此可見HBx同凋亡的關(guān)系是非常復(fù)雜的，可能具有雙重調(diào)節(jié)作用，而細(xì)胞凋亡是多個基因相互作用的最終結(jié)果。

［1］Zhang JL，Zhao WG，Wu KL，et al.Human hepatitis B virus X protein promotes cell proliferation and inhibits cell apoptosis through interacting with a serine protease Hepsin［J］.Arch Virol，2005，150(4):721-741.

［2］Li D，Chen X，Zhang W.The inhibition of apoptosis of hepatoma cells induced by HBx is mediated by up-regulation of survivin expression［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2003，23(4):383-386.

［3］Cheng P，Li Y，Yang L，et al.Hepatitis B virus X protein(HBx)induces G2/M arrest and apoptosis through sustained activation of cyclin B1-CDK1 kinase［J］.Oncol Rep，2009，22(5):1101-1107.

［4］Kim HJ，Kim SY，Kim J，et al.Hepatitis B virus X protein induces apoptosis by enhancing translocation of Bax to mitochondria［J］.IUBMB Life，2008，60(7):473-480.

［5］楊盛力，陳孝平，張萬廣，等.乙肝病毒X蛋白通過激活核因子-κB信號通路上調(diào)MDR1的表達(dá)［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2008，25(12):1603-1605.

［6］馬大龍.新細(xì)胞因子及細(xì)胞凋亡基因的發(fā)現(xiàn)與功能研究［J］.北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2002，34(5):488-492.

［7］楊盛力，陳孝平，張萬廣，等.PDCD5在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國普通外科雜志，2008，17(7):721-724.

［8］Chen Y，Sun R，Han W，et al.Nuclear translocation of PDCD5(TFAR19):an early signal for apoptosis?［J］.FEBS Lett，2001，509(2):191-196.

［9］阮國瑞，陳珊珊，常艷，等.腺病毒介導(dǎo)PDCD5基因轉(zhuǎn)移促進(jìn)依托泊甙誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2007，15(5):936-940.

［10］Rui M，Chen Y，Zhang Y，et al.Transfer of anti-TFAR19 monoclonal antibody into HeLa cells by in situ electroporation can inhibit the apoptosis［J］.Life Sci，2002，71(15):1771-1778.

［11］楊盛力，陳孝平，張萬廣，等.肝癌組織中Livin基因表達(dá)及與乙型肝炎病毒X蛋白的關(guān)系研究［J］.中華普通外科雜志，2008，23(12):921-923.