張榮濤， 李向農(nóng)

原發(fā)性肝癌與肝硬化的關(guān)系密切，而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)在肝硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。HSCs活化后可以分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子［1］。20世紀(jì)80 年代 Knook等［2］最早用鏈酶蛋白酶、膠原酶灌注消化的方法分離得到HSCs。但是分離方法復(fù)雜，條件苛刻，尤其是酶灌注時(shí)間及密度梯度離心液的精確配置不易把握。目前現(xiàn)有的許多分離方法需要特殊的循環(huán)設(shè)備及昂貴的密度梯度離心液。本研究借鑒國內(nèi)外先進(jìn)的HSCs分離方法［3-5］，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，探索出一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠的HSCs分離方法，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠20只，體重400～500 g，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食。

1.1.2 主要試劑 Ⅳ型膠原酶、鏈酶蛋白酶、Percoll、DNA酶(均是sigma產(chǎn)品)，DMEM高糖型培養(yǎng)基、PBS(北京索萊寶公司)，胎牛血清(無支原體級(jí))(杭州四季青)，Desmin抗體(bioword)，SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德)。

1.2 方法

1.2.1 液體配制 (1)灌注酶:鏈酶蛋白酶100 mg，Ⅳ型膠原酶 50 mg，D-Hanks 100 mL。(2)消化酶:Ⅳ型膠原酶

50 mg，鏈酶蛋白酶20 mg，DNA酶10 mg，D-Hanks 100 mL。(3)密度梯度離心液:9份Percoll加 1 份 1.5M PBS，配置成 100% 的 Percoll。用0.15M的PBS將100%的Percoll稀釋至39.5%，pH=7.4;用密度計(jì)測(cè)量密度并調(diào)整至1.053，濾器過濾。

1.2.2 HSCs的分離 SD大鼠用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉。碘伏消毒切口皮膚。腹部十字型切口入腹，入腹后暴露門靜脈，結(jié)扎肝動(dòng)脈、膽總管。在門靜脈遠(yuǎn)心端用眼科剪做“V”型切口，置入硬膜外麻醉用導(dǎo)管，結(jié)扎固定后連接輸液器。同時(shí)在下腔靜脈做一小切口，插入硬膜外導(dǎo)管，結(jié)扎固定，作為出液端。實(shí)驗(yàn)前將D-Hanks液、灌注酶、消化酶水浴至37℃。先用100 mL(含2 U/mL肝素)的D-Hanks經(jīng)門靜脈插管灌注肝臟，灌注時(shí)間約15 min。待肝臟變?yōu)橥咙S色時(shí)，改用50 mL灌注酶緩慢灌注。將下腔靜脈插管的出液端置于培養(yǎng)皿，收集流出的灌注酶，供重復(fù)灌注使用。灌注大約30 min(重復(fù)灌注3～5次)，至肝臟軟化時(shí)，剪下肝臟，置于培養(yǎng)皿。20 mL D-Hanks清洗3次，去除肝臟表面殘留灌注酶。剔除肝包膜及結(jié)締組織，剪碎肝組織;加入30 mL預(yù)熱的消化酶，消化20 min，可見肝組織變成細(xì)胞懸液，再加入1 mL胎牛血清終止消化。將細(xì)胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾，移入50 mL離心管，2 500 r/min離心 5 min，棄上清;3 mL D-Hanks懸浮沉淀，重復(fù)離心1次，棄上清;沉淀用6 mL DMEM懸浮，制成細(xì)胞懸液。取2個(gè)10 mL玻璃離心管，各加入5 mL密度梯度離心液，吸取3 mL細(xì)胞懸液緩慢加入離心液上方，保證兩層液體之間界面清楚。3 800 r/min離心30 min，可見上清與離心液之間有一層HSCs形成的絮狀沉淀。小心吸取此層沉淀，裝入10 mL玻璃離心管，3 mL DMEM懸浮，2 500 r/min離心5 min，重復(fù)1次，所得HSCs沉淀用3 mL含20%胎牛血清的DMEM懸浮，供細(xì)胞培養(yǎng)用，同時(shí)取90 μL細(xì)胞懸液以鑒定細(xì)胞活性。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) (1)原代培養(yǎng):將分離所得3 mL HSCs細(xì)胞懸液接種于50 mL塑料培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。24 h后換液，以后每48 h換液1次。一般10天左右細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約80%面積時(shí)，即可開始傳代培養(yǎng)。(2)傳代培養(yǎng):用1 mL 0.25%的胰酶加入培養(yǎng)瓶消化2 min。顯微鏡下觀察瓶壁細(xì)胞變圓后，棄去胰酶，加入2 mL含10%胎牛血清DMEM中止消化。吸管吹打，制成細(xì)胞懸液;移入10 mL玻璃離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清;沉淀用3 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮，每毫升細(xì)胞懸液接種于1個(gè)50 mL塑料培養(yǎng)瓶。將此傳代后的HSC置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。

1.2.4 HSCs活性鑒定 臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)，光鏡下觀察剛分離出的HSCs，未著色者為活細(xì)胞。

1.2.5 HSCs性質(zhì)鑒定 (1)形態(tài)學(xué):光鏡觀察原代HSCs培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化。(2)免疫細(xì)胞化學(xué):采用 Desmin抗體鑒定，將原代培養(yǎng)10天的HSCs以1×105/mL濃度接種于24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，冷丙酮固定，SABC法染色，DAB顯色，著色者為陽性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞得率及活率

本法分離的細(xì)胞得率為(2.35 ±0.15)×107/每肝，細(xì)胞活率為(95.5 ±0.6)%。

2.2 細(xì)胞性質(zhì)鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué) 剛分離的HSCs呈圓形、橢圓形，含較多脂滴，透明度高。24 h后細(xì)胞貼伸出偽足。培養(yǎng)7天后細(xì)胞呈明顯的梭形、星形，細(xì)胞透明度降低(圖1～3)。

圖1 剛分離的HSCs(×200)

圖2 原代培養(yǎng)7天的HSCs(×200)

圖3 原代培養(yǎng)第10天的HSCs(×200)

2.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué) 原代培養(yǎng)10天的HSCs用Desmin抗體鑒定，SABC法免疫細(xì)胞化學(xué)染色(圖4)。HSCs陽性率為(92.4 ±1.5)%。

圖4 原代培養(yǎng)10天的HSCs免疫細(xì)胞化學(xué)染色(SABC法，×200)

3 討論

HSCs在肝纖維化的過程中扮演重要角色［6］。HSCs的分離提取方法不斷改進(jìn)，其中以原位灌注法最常使用，但其步驟繁瑣，不易操作。為簡(jiǎn)化HSCs提取步驟，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，我們?cè)诔Ｒ?guī)方法的基礎(chǔ)上做了一些改進(jìn):(1)HSC與Kuffer細(xì)胞密度有一定交叉，密度梯度離心液的精確配制是細(xì)胞成功提取的前提。Percoll作為一種密度梯度離心介質(zhì)，粘滯度低，梯度容易形成，對(duì)細(xì)胞無毒性。本實(shí)驗(yàn)參考了不同濃度的Percoll密度表，將Percoll與PBS混勻，用密度計(jì)調(diào)配密度到1.053，有效保證了密度梯度離心液的精度，也降低了配液難度。(2)選用硬膜外導(dǎo)管作為門靜脈的插管。硬膜外導(dǎo)管在硬度與韌性方面是理想的大鼠門靜脈插管材料，可有效提高插管成功率，有利于控制灌注速度。但是，肝臟中的肝細(xì)胞與HSCs粘附緊密，酶消化不足將降低細(xì)胞得率，消化過度則降低細(xì)胞活性。因此，對(duì)肝臟消化程度的把握與實(shí)驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)有一定關(guān)系?？傊緦?shí)驗(yàn)方法分離提取HSCs無需特殊設(shè)備和昂貴試劑，在保證細(xì)胞得率、活率及純度的前提下簡(jiǎn)化了操作步驟，簡(jiǎn)單易行。

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［4］翁山耕，冷希圣，魏玉華，等.改良法大鼠肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，33(1):83-86.

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