隋華 周利紅 劉宣 殷佩浩 周寧 王炎 孫玨 范忠澤 李琦

上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院腫瘤科，

上海中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合腫瘤介入研究所，上海 200062

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是影響結直腸癌臨床化療療效的重要原因之一，結直腸癌產(chǎn)生多藥耐藥的機制較為復雜，其中多藥耐藥基因MDR1編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)在結直腸癌多藥耐藥中起著重要作用［1］。COX-2是花生四稀酸轉化為前列腺素過程中的一個關鍵限速酶，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要分子靶標之一。有研究表明，COX-2過表達與結直腸癌多藥耐藥密切相關，是結直腸癌多藥耐藥重要的促進因素，但其確切的機制尚不清楚［2-3］。本實驗采用含COX-2基因的重組慢病毒載體和COX-2特異性抑制劑上調或抑制人結腸癌敏感細胞HCT8和多藥耐藥HCT8/V細胞COX-2的表達，研究COX-2對人結腸癌細胞的化療藥物敏感性、MDR1 mRNA和P-gp表達的影響，探討COX-2對人結腸癌細胞多藥耐藥的影響和調控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑

人結腸癌細胞株HCT8及人結腸癌多藥耐藥細胞株HCT8/V由上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院實驗中心保存。載體質粒(pFU-GW)、pGCSIL-GFP質粒和293T細胞株購于上海博古生物公司；大腸埃希菌DH-5α為本實驗室保存；限制性內切酶XbaⅠ、XhoⅠ、HpaⅠ、NotⅠ、T4 DNA連接酶、PrimeSTARTM HS DNA多聚酶均購自大連寶生物公司；脂質體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購自天根生物公司。COX-2特異性的抑制劑NS-398購于美國Serologllcais公司；四甲基偶氮唑鹽MTT購自美國Sigma公司；總RNA抽提試劑RNAiso Reagent、熒光定量PCR試劑購于日本TaKaRa公司；GAPDH和MDR1上下游引物和探針由上海閃晶生物公司設計并合成。蛋白質抽提試劑盒(Sangon S-415)、BCA蛋白質定量試劑購于德國Merck公司；SDS-PAGE電泳試劑購自上海博彩生物技術有限公司；兔抗人P-gp單克隆抗體購自德國Merck公司。

1.1.2 儀器

Mastercyclerep銀質梯度PCR儀、Biophotometer生物分光光度計、5804R高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；ABI7300實時定量PCR儀購自美國ABI公司；CKX41/U-RFLT50熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Chemidox化學發(fā)光成像儀購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人結腸癌HCT8細胞在37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%，飽和濕度，含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，多藥耐藥HCT8/V細胞在上述培養(yǎng)體系基礎上加入終濃度為2 μg/mL的長春新堿(VCR)以維持耐藥性，細胞每1～2天傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 MTT實驗

取對數(shù)生長期人結腸癌敏感細胞株HCT8和耐長春新堿細胞株HCT8/V，分別調整細胞濃度至1×105mL-1，以每孔100 μL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，在CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度、37 ℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞貼壁3～5 h后，除對照組外各自加入含不同濃度化療藥物的培養(yǎng)基100 μL，每組設4個復孔。培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃溫育4 h后棄上清液，加入150 μL DMSO，震蕩混勻使MTT還原產(chǎn)物充分溶解后，酶標儀檢測570 nm波長處吸光度D值。計算細胞的生長抑制率和耐藥指數(shù)(resistance factor，RF)。計算公式：生長抑制率=(1-D實驗組均值/D對照組均值)×100%；RF=某種藥物針對抗藥性細胞的IC50/某種藥物針對敏感性細胞的IC50。以上實驗重復3次。

1.2.3 COX-2-GFP-Lentivirus重組慢病毒載體的構建并感染人結腸癌細胞

⑴慢病毒載體的構建和鑒定 將慢病毒pFU-GW進行AgeⅠ酶切，線性化處理，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段，并回收條帶。將COX-2基因PCR產(chǎn)物交換進入線性化慢病毒載體，加入的線性化載體DNA和純化的PCR產(chǎn)物的摩爾數(shù)比例為1∶3～1∶9之間，設置陽性對照和自連對照。將構建好的載體轉化入大腸埃希菌DH5α，長出克隆后進行PCR鑒定，鑒定陽性結果進行測序。⑵重組慢病毒包裝 取對數(shù)生長期細胞293T細胞，按照每孔1.2×106個細胞接種。轉染前2 h將細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，待細胞70%融合時分別將慢病毒表達載體與pGCSIL-GFP質?；靹?，加入250 μL OPTI-MEM去血清培養(yǎng)液，并用LipofectamineTM2000共轉染于相應的293T細胞組中。轉染后48 h后可置于熒光顯微鏡下觀察兩組細胞綠色熒光蛋白的表達情況，確定包裝成功。72 h后收集上清液，3 000 r/min離心(半徑10 cm)20 min，并經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，將病毒上清液保存于-80 ℃下備用。⑶孔稀釋法測定病毒滴度 將病毒儲存液按梯度稀釋至(10-1～10-3)，依次取10 μL加到細胞中，放入37℃，CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液，3～4 d后觀察熒光表達。正常情況下，熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應減少，計數(shù)最大稀釋倍數(shù)孔中的帶有熒光的細胞個數(shù)，病毒滴度(TU/mL)=(熒光細胞個數(shù)×轉染時細胞數(shù)/100×每孔加入病毒稀釋液體積)×100%/稀釋濃度。⑷COX-2-GFP-Lentivirus重組慢病毒載體感染人結腸癌細胞 將人結腸癌HCT8和多藥耐藥HCT8/V細胞分為3組：⑴空白對照組：HCT8和HCT8/V結腸癌細胞株；⑵陰性重組慢病毒組：分別進行陰性慢病毒GFPLentivirus感染；⑶COX-2重組慢病毒組：分別進行過表達COX-2重組慢病毒COX-2-GFPLentivirus感染。感染前2 d以胰酶消化HCT8和HCT8/V細胞，接種于24孔板，每孔計數(shù)(1～3)×105個細胞，當細胞長至50%的培養(yǎng)基面積時用于感染。將病毒原液稀釋1×106溶于5 mL培養(yǎng)基，100 μL LipofectamineTM2000溶于5 mL培養(yǎng)基。混合后20 min，緩慢加入HCT8和HCT8/V細胞中。24 h后將培養(yǎng)液換為含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。感染48 h后，將培養(yǎng)板中的細胞按1∶10比例接種，感染72 h后開始加130 μg/mL的Zeocin進行篩選，出現(xiàn)陽性克隆后，以100 μg/mL維持篩選15 d。

1.2.4 Real-time PCR實驗

按照表1中的序列設計內參基因GAPDH和目的基因MDR1的引物和探針，用RNAiso試劑分別提取細胞總RNA，并逆轉成cDNA，按Real-time PCR試劑盒方法以進行熒光定量PCR反應，體系(20 μL)如下：Premix EX TaqTM 10 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，熒光探針0.8 μL，dH2O 6 μL，cDNA 2 μL，反應條件： 95 ℃預變性10 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸31 s，40個循環(huán)，數(shù)據(jù)采用ABI 7300 SDS Software分析。相對mRNA表達水平按以下公式計算：相對mRNA表達量=2-△Ct，△Ct=Ct靶基因- CtGAPDH。

1.2.5 Western blot實驗

收集對數(shù)生長期各組細胞約2×106/組，用預冷PBS洗滌2次，吸棄PBS，加入預冷的蛋白裂解液在冰上裂解0.5 h，14 000×g離心15 min，吸棄上清液；BCA分析試劑測定蛋白質濃度。50 μg總蛋白質在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中電泳，PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗體，然后分別加入1∶1 000鼠抗人COX-2抗體，4 ℃過夜。次日用TBS/T洗膜3次，再加入HRP標記的二級抗體，室溫溫育1 h，ECL顯色。β-actin作內參對照，分析灰度值進行計算灰度系數(shù)比。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)采用表示，兩獨立樣本均數(shù)比較，采用Independent-samplestTest，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(Student-Newman-Keuls法)，計算組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表 1 實時熒光定量PCR檢測所需MDR1和GAPDH引物序列Tab.1 RFQ-PCR primers and Taqman probes sequences of MDR1 and GAPDH

2 結 果

2.1 人結腸癌細胞對多種化療藥物的敏感性

不同濃度的化療藥VCR、DDP、5-FU、THP對人結腸癌HCT8細胞48 h的IC50值分別為(18.2±7.1) μg/mL、(10.2±0.8) μg/mL、(7.5±0.8) μg/mL和(7.6±0.9) μg/mL；而對多藥耐藥HCT8/V細胞48 h的IC50值分別為(191.1±18.2) μg/mL、(290.8±28.4) μg/mL、(23.1±2.0) μg/mL和(26.4±2.9) μg/mL，HCT8/V細胞的耐藥指數(shù)分別為10.49、28.37、3.09和3.47，與HCT8細胞相比，HCT8/V細胞細胞具有明顯的多藥耐藥性(P＜0.01，表2)。

表 2 4種化療藥物對HCT8和HCT8/V敏感性的影響Tab.2 Effect on cytotoxicity of 4 chemotherapeutic drugs in HCT8 and HCT8/V cells

2.2 穩(wěn)定高表達COX-2的細胞株克隆

攜帶有COX-2基因的重組慢病毒載體COX-2-GFP-Lentivirus感染人結腸癌HCT8和HCT8/V細胞后發(fā)出亮綠色的GFP熒光，熒光顯微鏡觀察48 h的感染率＞80%(圖1)。

2.3 COX-2-GFP-Lentivirus對人結腸癌細胞COX-2表達的影響

含COX-2基因的重組慢病毒表達載體(COX-2-GFP-Lentivirus)感染人結腸癌HCT8和HCT8/V細胞后，提取細胞總蛋白進行Western blot檢測COX-2蛋白表達。結果顯示，感染含COX-2基因的重組慢病毒后，HCT8細胞內COX-2表達顯著上升，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而HCT8/V細胞由于基礎表達量較高，與對照組相比COX-2表達增加不明顯(圖2)。

2.4 COX-2對人結腸癌細胞化療藥物敏感性的影響

感染COX-2-GFP-Lentivirus后，人腸癌HCT8細胞對VCR對的IC50值從(18.2±7.1)μg/mL上升為(122.5±13.4)μg/mL，差異具有統(tǒng)計學意義(t=11.9，P＜0.01)；而抑制HCT8細胞COX-2后，細胞對VCR的敏感性無明顯變化。感染COX-2-GFP-Lentivirus后HCT8/V細胞對VCR的敏感性無明顯變化(P＞0.05)；而用NS-398(20 μmol/L，2 h)抑制HCT8/V細胞COX-2表達后，VCR對HCT8/V細胞的IC50值從(191.1±18.2) μg/mL下降到(32.2±7.5)μg/mL(t=14.0，P＜0.01，圖3)，提示調控COX-2的表達可以調節(jié)結腸癌細胞對化療藥物的敏感性。

2.5 COX-2對人結腸癌細胞MDR1 mRNA表達的影響

RFQ-PCR檢測結果顯示，HCT8/V細胞的MDR1 mRNA表達明顯高于HCT8細胞，兩者相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。感染COX-2-GFP-Lentivirus后，與對照組相比，HCT8細胞MDR1 mRNA表達明顯增加(P＜0.01)；而抑制COX-2表達后(NS-398，20 μmol/L，2 h)，HCT8/V細胞MDR1 mRNA表達下降了53.3%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖4)。

2.6 COX-2對人結腸癌細胞P-gp表達的影響

Western blot結果顯示，人結腸癌多藥耐藥HCT8/V細胞P-gp表達明顯高于HCT8細胞。感染COX-2-GFP-Lentivirus后，HCT8細胞P-gp表達明顯增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而抑制COX-2(NS-398，20 μmol/L作用2 h)后，HCT8/V細胞P-gp表達下降了42.5%，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。提示COX-2可以上調結腸癌HCT8細胞的P-gp表達，而抑制COX-2表達則可降低HCT8/V細胞的P-gp表達，說明COX-2能夠調控結腸癌細胞P-gp的表達(圖5)。

3 討 論

多藥耐藥是指腫瘤細胞長期接觸某一化療藥物，不僅對此種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，而且對其他結構和功能不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性的現(xiàn)象，是造成化療失敗的主要原因［4］。有研究表明，結直腸癌是MDR1/P-gp表達水平及頻率最高腫瘤之一［5］。當藥物進入細胞后，P-gp結合藥物分子，同時其ATP位點結合ATP后釋放能量，使藥物轉運到細胞外，同時也可直接從細胞膜排除藥物，使細胞內藥物濃度始終維持在低水平，細胞由此產(chǎn)生耐藥。因此，針對P-gp調節(jié)的研究，是目前逆轉結直腸癌細胞多藥耐藥、提高化療敏感性、減少結直腸癌化療失敗的重要途徑［6］。

研究發(fā)現(xiàn)，COX-2與MDR1/P-gp等耐藥相關基因關系密切，可調節(jié)腫瘤細胞MDR基因的表達［7］。COX-2為誘導型合酶，靜息時不表達，當細胞受到各種誘導因子刺激時可迅速合成，是炎癥過程中一個重要的誘導酶，并參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，可作為炎癥及腫瘤的一個重要的治療靶分子［8-10］。臨床研究顯示，結腸癌組織中COX-2蛋白呈高表達，其表達量較其周圍的正常黏膜有顯著增強，是結腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲的重要致癌因子［11］。

有研究發(fā)現(xiàn)，在消化道腫瘤中，COX-2的表達與MDR1/P-gp具有明顯正相關性，并且抑制COX-2的活性可以降低MDR1/P-gp介導的多藥耐藥［12］。Zatelli等［13］研究證實，NS-398可抑制乳腺癌rMCF7細胞內P-gp的表達，提高其對化療藥物的敏感性。本實驗發(fā)現(xiàn)抑制COX-2表達能使HCT8/V細胞對化療藥物更加敏感，降低細胞的耐藥性而增加化療藥物對細胞的殺傷作用；進一步研究證實COX-2的下調會直接降低HCT8/V細胞的MDR1 mRNA和P-gp的水平。說明COX-2可能通過降低MDR1的表達，影響P-gp的藥泵功能從而引發(fā)多藥耐藥的。此結果與Zrieki等［14］在人結腸腺癌Caco-2細胞中的發(fā)現(xiàn)相一致。

與傳統(tǒng)過表達質粒載體系統(tǒng)相比，慢病毒載體系統(tǒng)具有感染效率高、基因表達穩(wěn)定、不易引起免疫反應等優(yōu)點［15-17］。本研究結果發(fā)現(xiàn)上調COX-2的表達可以增強HCT8細胞對化療藥物的耐藥性，與Miller等［18］的研究結果相一致。說明COX-2基因可以誘發(fā)敏感細胞向耐藥細胞的轉變，降低正常腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。為了更進一步證實這種想法，我們采用RFQ-PCR、Western blot檢測細胞被COX-2-GFP-Lentivirus干預后MDR1 mRNA、P-gp的表達，結果發(fā)現(xiàn)：上調COX-2表達后，HCT8細胞的MDR1/P-gp表達明顯升高，提示COX-2可以引起腫瘤的多藥耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，其機制可能是通過介導MDR1/P-gp的表達實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究結果顯示，上調COX-2的表達具有明顯增加HCT8細胞耐藥性的作用，抑制COX-2可降低HCT8/V耐藥細胞MDR1 mRNA、P-gp的表達，從而逆轉多藥耐藥。這為以后深入探討COX-2對人結直腸癌多藥耐藥現(xiàn)象的發(fā)生、發(fā)展提供實驗依據(jù)。

［1］Pajak B, Orzechowski A.Overview how adenocarcinoma cancer cells avoid immune- and chemotherapy-induced apoptosis ［J］.Adv Med Sci, 2006, 51: 39-45.

［2］Menter DG, Schilsky RL, DuBois RN.Cyclooxygenase-2 and cancer treatment: understanding the risk should be worth the reward ［J］.Clin Cancer Res, 2010, 16(5): 1384-1390.

［3］張夢曦, 顧康生.化療藥物與腫瘤細胞環(huán)氧化酶-2表達及多藥耐藥之間相互關系的研究進展［J］.臨床腫瘤學雜志, 2009, 14(4): 377-380.

［4］Kuo MT.Roles of multidrug resistance genes in breast cancer chemoresistance ［J］.Adv Exp Med Biol, 2007, 608: 23-33.

［5］李艷紅, 王永華, 李燕, 等.MDR1基因多態(tài)性及其臨床相關性研究進展 ［J］.遺傳學報, 2006, 33(2): 93-104.

［6］隋華, 李琦.JNK/SAPK信號轉導通路與多藥耐藥機制的研究［J］.腫瘤防治研究, 2010, 37: 844-847.

［7］Bassiouny AR, Zaky A, Neenaa HM.Synergistic effect of celecoxib on 5-fluorouracil-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma patients ［J］.Ann Hepatol, 2010,9(4): 410-418.

［8］Gasparini G, Longo R, Sarmiento R, et al.Inhibitors of cyclooxygenase 2: a new class of anticancer agents? ［J］.Lancet Oncol, 2003, 4(10): 605-615.

［9］Zidar N, Odar K, Glavac D, et al.Cyclooxygenase in normal human tissues--is COX-1 really a constitutive isoform, and COX-2 an inducible isoform? ［J］.J Cell Mol Med, 2009,13(9B): 3753-3763.

［10］Subbaramaiah K, Dannenberg AJ.Cyclooxygenase2: a molecular target for cancer prevention and treatment ［J］.Trends Pharmacol Sci, 2003, 24(2): 96-102.

［11］Haile RW, Yochim JM, Cortessis VK, et al.A molecular/epidemiologic analysis of expression of cyclooxygenases 1 and 2, use of nonsteroidal antiinflammatory drugs, and risk of colorectal adenoma ［J］.Clin Colorectal Cancer, 2005, 4(6):390-395.

［12］Patel VA, Dunn M, Sorokln A.Regulation of MDR1(p-glycoprotein) by cyelooxygenase-2［J］.J Biol Chem,2002, 277(41): 38915-38920.

［13］Zatelli MC, Luchin A, Tagliati F, et al.Cyclooxygenase-2 inhibitors prevent the development of chemoresistance phenotype in a breast cancer cell line by inhibiting glycoprotein p-170 expression ［J］.Endocr Relat Cancer,2007, 14(4): 1029-1038.

［14］Zrieki A, Farinotti R, Buyse M.Cyclooxygenase inhibitors down regulate P-glycoprotein in human colorectal Caco-2 cell line ［J］.Pharm Res, 2008, 25(9): 1991-2001.

［15］孟坡, 任兆瑞.慢病毒載體介導的轉基因整合位點研究方法［J］.醫(yī)學分子生物學雜志, 2008, 5(5): 436-439.

［16］王雪峰, 何援利.攜帶人bcl-2基因的慢病毒表達載體的構建及其在人原代卵巢顆粒細胞中的表達［J］.南方醫(yī)科大學學報, 2008, 28(10): 1856-1859.

［17］宋麗萍, 李躍萍, 邱曙東, 等.NT4-p53(N15)-Ant重組慢病毒的構建及其對肝癌細胞的殺傷效應［J］.中華腫瘤雜志, 2010, 32(1): 10-16.

［18］Miller B, Patel VA, Sorokin A.Cyclooxygenase-2 rescues rat mesangial cells from apoptosis induced by adriamycin via upregulation of multidrug resistance protein 1 (P-glycoprotein)［J］.J Am Soc Nephrol, 2006 , 17(4): 977-985.