牛國梁 王輝 謝榮俊 張樹友

南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院普外科，湖南 衡陽 421002

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，對早期患者實行保乳治療加放療已是當(dāng)今的總趨勢。放療正成為乳腺癌局部和區(qū)域治療的重要手段，但腫瘤細(xì)胞本身對放射線的敏感性差、在放療中存在放射抗拒等因素影響了放療療效，且放療不良反應(yīng)大。因此，尋找一種高效低毒的放療增敏劑成為研究的熱點。塞來昔布(celecoxib)是環(huán)氧化酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)的選擇性抑制劑，其具有高效低毒、胃腸道反應(yīng)小等特點，研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布不僅能抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，還能提高腫瘤放療和化療的敏感性，其確切機(jī)制尚不明確［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路在腫瘤的放射抵抗性中起重要作用［3］。本實驗研究塞來昔布對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞放射敏感性的影響，并探討塞來昔布是否通過阻斷PI3K/Akt信號通路提高其放射敏感性。

1 材料和方法

1.1 材料及主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞研究所提供；PRMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國GIBCO BRL公司產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；塞來昔布為美國輝瑞公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)為Sigma公司產(chǎn)品；鼠抗人pAkt、Akt單克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體購美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；羊抗兔二抗為北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量檢測試劑盒為美國Pierce公司產(chǎn)品；ECL發(fā)光檢測試劑盒為聯(lián)科公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶貼壁面至70%～80%融合時胰蛋白酶消化傳代一次，傳代后取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 細(xì)胞照射

直線加速器為德國Siemens Primus，6MV X-ray，將直線加速器機(jī)架角度為180度，劑量率200 cGy/min，射野大小為10 cm×10 cm，源皮距(source skin distance，SSD)為100 cm，加1.5 cm等效組織(培養(yǎng)瓶倒置于治療床面，培養(yǎng)瓶的細(xì)胞面朝上，并在瓶面上加墊1.5 cm厚等效有機(jī)玻璃板)。

1.4 MTT法檢測塞來昔布的細(xì)胞毒性

取對數(shù)生長期細(xì)胞(細(xì)胞濃度為2×104mL-1)，以每孔200 μL接種于96孔板，于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h貼壁后，換成含塞來昔布終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L和60 μmol/L繼續(xù)培養(yǎng)，對照組為含0.5%DMSO的培養(yǎng)液，每一濃度設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT 20 μL(以PBS配成5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加DMSO 150 μL，震蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長測定各孔的光密度值(D值)。以上實驗重復(fù)3次。按公式：細(xì)胞生長抑制率=(1-D實驗組/D對照組)×100%。計算藥物對MDA-MB-231細(xì)胞生長抑制率，并計算塞來昔布IC50和IC20，取IC20作為后續(xù)實驗濃度。

1.5 克隆形成實驗

MTT實驗得到塞來昔布IC20值20 μmol/L，即為實驗濃度。實驗分4組，對照組：含有和其他組相等濃度的DMSO溶解劑；藥物組：DMSO溶解的塞來昔布；照射組：X線照射；實驗組：塞來昔布聯(lián)合X線照射。對照組及藥物組于細(xì)胞貼壁后，分別更換含或不含20 μmol/L塞來昔布培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，0.25%胰酶消化，懸浮細(xì)胞，臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活性并計數(shù)活細(xì)胞，按100個細(xì)胞/孔，接種于12孔培養(yǎng)板，無藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10 d左右。照射組及實驗組于細(xì)胞貼壁后，實驗組更換含20 μmol/L塞來昔布培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。照射組及實驗組分別給予0、2、4、6、8、10 Gy X-ray照射，劑量率為200 cGy/min，照射后，消化、懸浮、計數(shù)活細(xì)胞，根據(jù)不同照射劑量(由低到高)，分別接種100、100、500、500、1 000、1 000個細(xì)胞于12孔培養(yǎng)板。無藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10 d左右，甲醇固定，Gimsa染色，低倍倒置顯微鏡下計數(shù)各孔細(xì)胞數(shù)大于50個的細(xì)胞集落數(shù)，計算存活分?jǐn)?shù)，繪制劑量效應(yīng)曲線?？寺÷?plating efficiency，PE)=對照組每孔克隆數(shù)/每孔細(xì)胞種植數(shù)×100%，以PE作為校正系數(shù)計算存活分?jǐn)?shù)(surviving fraction，SF)，SF=實驗組每孔克隆數(shù)/(每孔細(xì)胞種植數(shù)×克隆率)，以單擊多靶數(shù)學(xué)模型擬合細(xì)胞存活曲線，計算出照射組和實驗組的準(zhǔn)域劑量(Dq)、平均致死劑量(D0)、2 Gy照射的存活分?jǐn)?shù)(SF2)值，放射增敏效應(yīng)以放射增敏比(SERD0)表示，定義為照射組與實驗組的D0之比。上述實驗重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞分析法(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測腫瘤細(xì)胞凋亡

按上述實驗分組，取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞2×106個消化，懸浮，接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶貼壁面至70%～80%融合時，對照組及照射組更換含0.5% DMSO培養(yǎng)液，藥物組和實驗組更換20 μmol/L塞來昔布培養(yǎng)液，以照射劑量為6 Gy干預(yù)后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集細(xì)胞。75%冰乙醇固定，在4℃固定24 h，去固定液，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。上述實驗重復(fù)3次。

1.7 Western blot法檢測Akt、pAkt表達(dá)

按上述實驗分組，對照組及照射組更換含0.5% DMSO培養(yǎng)液，藥物組和實驗組更換20 μmol/L塞來昔布培養(yǎng)液，以照射劑量為6 Gy干預(yù)后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法蛋白定量，取40 μg蛋白SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至已用甲醇激活的硝酸纖維素膜(PVDF)上，封閉液震動封閉1 h，分別加入抗pAkt、Akt、β-actin一抗，37 ℃溫育1 h，洗膜后加入相應(yīng)二抗37 ℃溫育1 h。暗室中用ECL發(fā)光法顯色，曝光，顯影，定影，水洗。以上實驗重復(fù)3次。膠片用薄層掃描儀進(jìn)行灰度掃描，用AlphaImager 2200軟件分析各產(chǎn)物的灰度值，將各灰度值與對應(yīng)標(biāo)本β-actin對照的灰度值相比，計算出樣本蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析；兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT實驗結(jié)果

MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度塞來昔布作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，有明顯的抑制作用，并且呈劑量依賴性。根據(jù)藥物效應(yīng)中效方程式法計算出藥物IC50、IC20分別約為(50.14±2.42) μmol/L、(20.21±1.34) μmol/L。選擇IC2020 μmol/L作為后續(xù)實驗濃度。

2.2 克隆形成實驗結(jié)果

照射組和實驗組克隆形成后，計算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)并通過單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線(圖1)，計算出Dq、D0、SF2值(表1)。可以看出，實驗組Dq、D0、SF2明顯低于照射組，且放射增敏比SERD0為1.277，表明塞來昔布對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231具明顯放射增敏作用。

表 1 照射組和實驗組細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)Tab.1 The radiobiological parameters of the MDA-MB-231 cells after treatment

2.3 FCM檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

與對照組相比，塞來昔布和單純照射與對照組相比，均能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡(t=15.49，P＜0.05；t=24.69，P＜0.05)，兩者聯(lián)合作用交單純照射組的效果更顯著(t=14.01，P＜0.05) (圖2，表2)，說明塞來昔布能提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞對放射線的敏感性。

表 2 MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率的比較Tab.2 Comparison of apoptosis rates in MDA-MB-231cells after treatment

2.4 Western blot法檢測Akt、pAkt表達(dá)結(jié)果

以β-actin為內(nèi)參照，Western blot法檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果顯示，實驗各組Akt蛋白表達(dá)沒有明顯的差異，各組蛋白相對灰度分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。塞來昔布能抑制pAkt表達(dá)，而放射線能提高pAkt表達(dá)，兩者聯(lián)合使用后pAkt蛋白表達(dá)比單純照射組降低。各組pAkt蛋白相對灰度分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

3 討 論

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸生物合成前列腺素(prostaglandin，PG)的限速酶，PG參與機(jī)體多種生理及病理過程。COX分為COX-1型和COX-2型。COX-1主要參與體內(nèi)正常的生理過程。COX-2為誘生表達(dá)，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4-5］。塞來昔布是一種高選擇性的COX-2抑制劑，它能通過阻滯腫瘤細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡、阻斷腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制表達(dá)、抑制腫瘤新血管生成等起到抗腫瘤作用［6-8］。研究還發(fā)現(xiàn)，塞來昔布可增強(qiáng)放射線對腫瘤的作用，但其機(jī)制尚未清楚，其可能的機(jī)制有：降低細(xì)胞內(nèi)前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)水平，去除放射保護(hù)、抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡、阻滯于對放射線敏感的細(xì)胞周期［9］、抑制DNA損傷的修復(fù)［10］、抗血管生成等［11］。PI3K/Akt信號通路在絕大多數(shù)人類腫瘤中表達(dá)失調(diào)，調(diào)節(jié)著腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，并且與腫瘤的血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移以及對化學(xué)耐藥、放療抗拒密切相關(guān)［12-13］。但PI3K/Akt信號通路與塞來昔布在腫瘤細(xì)胞放射增敏中的作用及機(jī)制尚不清楚。

本實驗研究塞來昔布對人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞放射線的作用，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，塞來昔布能夠明顯提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性?？寺⌒纬蓪嶒瀱螕舳喟心Ｐ褪呛饬考?xì)胞放射敏感性的最廣泛的方法。本研究克隆形成實驗結(jié)果顯示，塞來昔布對MDAMB-231細(xì)胞有明顯的放射增敏作用。塞來昔布聯(lián)合X線照射組的Dq、D0、SF2較單純照射組均降低，SERD0為1.277。Dq減小，說明細(xì)胞存活曲線肩區(qū)縮小，放射抗拒性降低；D0減小，SF2降低，放射抗拒性降低，使細(xì)胞亞致死損傷修復(fù)能力降低從而達(dá)到放射增敏的效果。這可能是塞來昔布降低腫瘤細(xì)胞的放射抗拒，提高放射敏感性的重要因素。

腫瘤細(xì)胞在受到放射線作用于后，細(xì)胞內(nèi)會發(fā)生一系列生物化學(xué)反應(yīng)，以修復(fù)其受損的結(jié)構(gòu)和功能，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的克隆源性增殖能力，甚至增強(qiáng)增殖能力，從而使腫瘤細(xì)胞對放射線產(chǎn)生抗拒，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡或死亡。而細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在這一過程中起了重要的作用。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)通路是一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、血管生成等方面發(fā)揮重要作用［14-15］。Akt又稱蛋白激酶B (protein kinase B，PKB)是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心，是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)下游最主要的作用靶標(biāo)，PI3K激活的Akt可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase 9、NF-κB、mTOR、Par-4、P21等，從而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞存活［16］。我們實驗發(fā)現(xiàn)，實驗各組Akt在蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變，而塞來昔布組pAkt蛋白明顯低于對照組，說明塞來昔布能夠抑制Akt磷酸化，這與Barnes等［17］研究的塞來昔布能夠抑制COX-2，從而抑制Akt磷酸化一致。而單純放射組提高pAkt蛋白的表達(dá)，推測照射后Akt磷酸化可能是細(xì)胞對射線損傷的一個早期反應(yīng)事件，這也可能是腫瘤細(xì)胞放射抗拒的重要原因。塞來昔布聯(lián)合照射線組pAkt蛋白低于單純照射組，說明塞來昔布具有抑制放射線誘導(dǎo)Akt磷酸化的作用，增強(qiáng)了放射敏感性。

我們的研究提示，放射線可誘導(dǎo)MDAMB-231細(xì)胞PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，提高腫瘤細(xì)胞的放射抗拒，塞來昔布則能夠抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，從而提高了乳腺癌放射敏感性。

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