肖秀英 于寶華 王麗莎 倪淑娟 楊曉燕 朱玉芬

1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科，上海 200031；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高及生活習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。作為細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和抗凋亡的重要調(diào)節(jié)通路——PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用仍未完全闡明［1］。本研究采用免疫組化EnVison法同時(shí)檢測(cè)結(jié)直腸癌原發(fā)灶及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶組織中PI3K、p-Akt及mTOR的表達(dá)，探討它們?cè)诮Y(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 資料

收集上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院2007—2008年手術(shù)切除的結(jié)直腸癌原發(fā)灶及相應(yīng)的轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本各60例，均經(jīng)病理證實(shí)為腺癌，術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療。其中，男性33例，女性27例；年齡24～78歲，中位年齡52歲；發(fā)病部位結(jié)腸26例，直腸34例；肝轉(zhuǎn)移灶2例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶58例。根據(jù)WHO腫瘤組織學(xué)分類(lèi)，高分化腺癌4例，中分化腺癌34例，低分化腺癌22例。另選10例癌旁正常結(jié)腸黏膜組織作對(duì)照。

1.2 組織標(biāo)本的制備

將結(jié)直腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織蠟塊標(biāo)本收齊后制備成厚5μm連續(xù)切片，每塊組織的連續(xù)切片中，均取一張做HE染色對(duì)照。

1.3 免疫組化檢測(cè)

采用EnVision兩步法，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PI3K(p110α)、p-Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)購(gòu)于Cell Signal公司，均為兔抗人濃縮型單克隆抗體，工作濃度依次為1∶100、1∶50、1∶50。EnVision試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。切片脫蠟入水后，于95 ℃～98 ℃檸檬酸鹽緩沖液(pH為6.0±0.1)中水浴修復(fù)15 min，自然冷卻至室溫(約25℃)。擦干切片周?chē)郑?% H2O2室溫溫育10 min，TBS沖洗3次，每次5 min，加入一抗工作液4 ℃過(guò)夜，TBS漂洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃下溫育45 min，TBS漂洗3次，每次5 min，DAB室溫下顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，充分沖洗中止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染胞核，染色1 min，1%鹽酸乙醇分色3 s，脫水透明、封片。

1.4 結(jié)果判斷

［2］方法觀(guān)察PI3K蛋白的分布和陽(yáng)性率。PI3K和p-Akt均為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，mTOR在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)，鏡下觀(guān)察腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒，染色明顯高于背景為陽(yáng)性。陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)：染色定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)均為陽(yáng)性，未見(jiàn)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞者為0分，陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)＜10%者為1分，陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)≥10%者為2分。0分和1分均視為陰性，2分視為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用χ2檢驗(yàn)和四格表的精確概率法，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5對(duì)各指標(biāo)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶組織中PI3K的表達(dá)

PI3K蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，鏡下癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，同一患者原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶表達(dá)見(jiàn)圖1A、B。本組60例結(jié)直腸癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶組織中，PI3K陽(yáng)性率分別為30.0%(18/60)和46.7%(28/60)；轉(zhuǎn)移灶陽(yáng)性率高于原發(fā)灶，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明結(jié)直腸癌癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移后PI3K表達(dá)能力增加(表1)。

2.2 結(jié)直腸癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶組織中p-Akt的表達(dá)

p-Akt主要定位于細(xì)胞質(zhì)，癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖2A、B)。60例結(jié)直腸癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶組織中，p-Akt的陽(yáng)性率分別為53.3%(32/60)和50.0%(30/60)，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移前后癌細(xì)胞p-Akt的表達(dá)無(wú)變化(表1)。10例癌旁正常黏膜陽(yáng)性率為20.0%(2/10)。

2.3 結(jié)直腸癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶組織中mTOR表達(dá)

mTOR主要定位于細(xì)胞質(zhì)，癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖3A、B)。60例結(jié)直腸癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶組織中，mTOR的陽(yáng)性率分別為41.7%(25/60)和55.0%(33/60)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移后癌細(xì)胞mTOR的表達(dá)增強(qiáng)(表1)。此外，本組結(jié)直腸癌組織中PI3K和mTOR的表達(dá)與其分化程度、患者年齡、性別、發(fā)生部位均無(wú)關(guān)(P＞0.05)。

3 討 論

PI3K是一類(lèi)特異性磷酸化肌醇磷脂3位羥基的激酶，稱(chēng)為PI3Ks家族。依據(jù)PI3Ks結(jié)構(gòu)和底物的特異性不同，將PI3Ks分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型［3］。Ⅰ型又可分ⅠA和ⅠB兩個(gè)亞型，受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)活化ⅠA型PI3Ks，G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)活化ⅠB型PI3Ks。其中Ⅰ型PI3Ks是由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成的異二聚體，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［4］。活化的PI3K可使磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇4-磷酸(PI-4-P)、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphate idylinositol-4，5-bisphosphate，PI-4，5-P2)肌醇環(huán)的第3位發(fā)生磷酸化，產(chǎn)生磷酸化磷酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphate idylinositol-3，4，5-trisphosphate，PI-3，4，5-P3)［5］。目前認(rèn)為PI-3，4-P2和PI-3，4，5-P3是細(xì)胞內(nèi)新型的第二信使，與胞質(zhì)內(nèi)含有血小板-白細(xì)胞C激酶同源(pleckstrin homology，PH)區(qū)的信號(hào)分子結(jié)合后發(fā)揮活性調(diào)節(jié)作用。在本組60例結(jié)直腸癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶組織中， PI3K陽(yáng)性率分別為30.0%(18/60)和46.7%(28/60)；轉(zhuǎn)移灶陽(yáng)性率高于原發(fā)灶，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明結(jié)直腸癌癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移后PI3K表達(dá)能力增加，提示PI3K與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。有研究表明，抑制PI3K活性可促進(jìn)加工caspase-3的蛋白酶活化或增加caspase-3對(duì)該蛋白酶的敏感性， 因此PI3K可能通過(guò)抑制caspase-3活化來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用［6］。

Akt即蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種相對(duì)分子質(zhì)量為57×103的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、PI3K的下游分子，與致小鼠白血病的病毒癌基因v-Akt高度同源，故名Akt。因其激酶活性區(qū)的氨基酸序列與蛋白激酶A和蛋白激酶C高度相似，故稱(chēng)PKB。通過(guò)PH區(qū)和PIP3結(jié)合，通過(guò)磷脂酰肌醇依賴(lài)性激酶1，2(PDK1、PDK2)使其第308位上的蘇氨酸位點(diǎn)(Thr308)和第473位上的絲氨酸位點(diǎn)(Ser473)磷酸化而被激活［7］。目前主要認(rèn)為Akt介導(dǎo)體內(nèi)PI3K依賴(lài)的細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，Akt的表達(dá)在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中無(wú)差別，提示Akt在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中變化不明顯，可能是結(jié)直腸發(fā)生過(guò)程中的早期事件。隨后我們檢測(cè)了10例癌旁正常黏膜Akt的表達(dá)情況，結(jié)果陽(yáng)性率為20.0%，表明Akt可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生早期發(fā)揮重要作用，這與以往研究結(jié)果一致［8］。近來(lái)也有學(xué)者報(bào)道，應(yīng)用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中Akt陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常黏膜，與本報(bào)道結(jié)果一致［9］。但湯建民等［10］報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌組織中磷酸化Akt表達(dá)增加，與腫瘤組織分化程度、臨床分期以及有無(wú)淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，結(jié)直腸癌組織中Akt的表達(dá)與腫瘤是否轉(zhuǎn)移存在確切關(guān)系，可能需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。

表 1 結(jié)直腸癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶組織中PI3K、p-Akt、mTOR的表達(dá)Tab.1 Expression of PI3K, p-Akt and mTOR in colorectal carcinoma and its metastasis spots

雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)是1991年被發(fā)現(xiàn)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是Akt下游的一個(gè)重要靶基因，屬于PIKKS家族(包括DNA-PK、ATM、ATR和MG-1)。由于其羧基末端與PI3K催化區(qū)高度同源，被認(rèn)為是PI3K相關(guān)的蛋白激酶家族成員。在哺乳動(dòng)物中存在序列保守的TOR基因，稱(chēng)之為mTOR?；罨腜I3K/Akt通過(guò)TSC1/2復(fù)合物進(jìn)一步激活其下游分子mTOR。mTOR能夠磷酸化它的2個(gè)下游分子，即翻譯抑制分子eIF4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding protein，4EBP1)和核糖體蛋白p70S6K(ribosomal70S 6 kinase，RSK)［11］。4EBP1磷酸化后失活，降低了與eIF4E的結(jié)合能力，解除了eIF4E和4EBP1之間的相互作用，使eIF4E與之分離，并與其他翻譯起始因子結(jié)合，從而啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯。而pS6K磷酸化后激活其功能，增加了cyclinD1、CDK4、CDC25A和Rb磷酸化的表達(dá)，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成［12］。在本研究60例結(jié)直腸癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶組織中，mTOR的陽(yáng)性率分別為41.7%(25/60)和55.0%(33/60)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移后癌細(xì)胞mTOR的表達(dá)增強(qiáng)。這與項(xiàng)洪剛等［13］研究的結(jié)直腸癌組織中mTOR的陽(yáng)性率42.2%相一致。

總之，PI3K和mTOR在結(jié)直腸癌組織高表達(dá)，且在轉(zhuǎn)移灶的陽(yáng)性率較原發(fā)灶高，將有助于加深對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的理解，為結(jié)直腸癌的基因治療和藥物治療提供了一定的分子生物學(xué)依據(jù)。

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