馬文慧 侯琳 韓琳琳

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山東 青島 266021

D NA甲基化是腫瘤發(fā)生的一個(gè)早期特征，通過基因組總體水平低甲基化和某些啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化造成基因功能的失活，從而導(dǎo)致腫瘤的形成［1］。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)是體內(nèi)甲基的直接供體，通過甲硫氨酸循環(huán)及葉酸代謝得到補(bǔ)充，故推測(cè)此循環(huán)障礙可能導(dǎo)致甲基化異常。甲硫氨酸合成酶(methionine synthase，MS)是參與甲基供體生成的關(guān)鍵酶，已發(fā)現(xiàn)MS基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病相關(guān)［2］，其多態(tài)性可能通過影響基因的表達(dá)，使酶水平或活性改變，導(dǎo)致DNA合成紊亂和甲基化異常［3］。BRCA1基因是非常重要的乳腺癌易感基因和抑癌基因，散發(fā)性乳腺癌罕見BRCA1基因突變，但癌組織中該基因表達(dá)卻顯著下降，目前研究認(rèn)為這與BRCA1啟動(dòng)子甲基化有關(guān)，但對(duì)BRCA1基 因甲基化機(jī)制的報(bào)道尚顯不足。散發(fā)性乳腺癌BRCA1甲基化與腫瘤分級(jí)［4］、癌組織分型［5］、激素受體［6-7］相關(guān)，但其與雌激素受體(estrogen receptor，ER)陰性/陽性相關(guān)尚無定論。本研究首先檢測(cè)乳腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織、乳腺良性病變組織中BRCA1 mRNA的表達(dá)水平及甲基化狀態(tài)，同時(shí)檢測(cè)葉酸代謝過程中關(guān)鍵酶MS基因的表達(dá)，探討該酶與BRCA1基因甲基化及其與乳腺癌發(fā)生的關(guān)系，從而為腫瘤甲基化機(jī)制及乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1 乳腺癌組織標(biāo)本

病例組選取2009年8月—2009年11月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行外科 手術(shù)切除新鮮組織標(biāo)本71例，其中良性病變組織9例、乳腺癌及癌旁組織(距癌＞3 cm)各31例(獲知情同意)，標(biāo)本切除后迅速放入-70 ℃冰箱保存。術(shù)前所有患者皆未接受治療，術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)確診。全部乳腺癌病例戶籍均為山東地區(qū)，無家族乳腺癌發(fā)病史。

1.1.2 主要試劑

MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Wizard DNA clean up純化試 劑盒購自美國Promega公司，對(duì)苯二酚和亞硫酸氫鈉購自美國Sigma公司，耐熱DNA

聚合酶購自大連寶生物公司，飽和酚購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

GeneAmp2400PCR反應(yīng)儀(PE公司)，紫外分光光度計(jì)(Eppendorf公司)，5415D高速離心機(jī)(Eppendorf公司)，5417R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)

1.2 方法

1.2.1 組織DNA、RNA提取

采用酚-氯仿抽提法提取組織DNA，DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照FASTAGEN-RNAfast200試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)公司產(chǎn)品)操作說明提取組織總RNA。RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定D260(260 nm光密度值)與D280(280 nm光密度值)，計(jì)算D260/D280比值，計(jì)算RNA的純度與濃度。用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。

1.2.2BRCA1基因的反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)

用2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA經(jīng)半定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，BRCA1及內(nèi)參照β-actin特異性引物的序列和擴(kuò)增片段長度見表1。PCR為25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中電泳，由Quantity One 4.6.6 (BIO-RAD)分析條帶D值。

1.2.3 組織DNA的亞硫酸氫鹽處理

在50 μL反應(yīng)體系中加入2 μg DNA和3 mol/L NaOH 5.5 μL，42 ℃水浴30 min，再加入新鮮配制的對(duì)苯二酚30 μL，3.6 mol/L亞硫酸氫鈉520 μL，50 ℃水浴16 h。采用Wizard DNA clean-up system (Promega公司)純化試劑盒純化修飾過的DNA。純化后的DNA加入3 mol/L NaOH 5.5 μL，37 ℃溫育15 min，加入10 mol/L乙酸銨33 μL和冰無水乙醇270 μL于-20 ℃沉淀過夜，然后4 ℃，12 000 r/min離心棄上清液(半徑6.5 cm)，用70%乙醇洗滌后將沉淀溶于20 μL去離子水中，于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.2.4BRCA1的甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation specific PCR, MSP)

用亞硫酸氫鹽修飾 的DNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，BRCA1引物參照文獻(xiàn)［8］設(shè)計(jì)(表1)。PCR反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)果用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用凝膠成像自動(dòng)分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：觀察純化后的DNA以不同引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，若用甲基化引物可擴(kuò)出產(chǎn)物，而未甲基化引物不能擴(kuò)出者，計(jì)為“+”，即完全甲基化；反之計(jì)為“-”，為完全未甲基化；均有產(chǎn)物者計(jì)為“±”，即部分甲基化。

1.2.5MS基因的檢測(cè)

方法同1.2.2，MS基因反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5和SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，兩個(gè)獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，MS基因表達(dá)與BRCA1甲基化的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織中BRCA1 mRNA表達(dá)

乳腺良性病變組織BRCA1 mRNA均有表達(dá)，乳腺癌組織、癌旁組織BRCA1 mRNA出現(xiàn)低表達(dá)或缺失，31例乳腺癌組織中，17例BRCA1 mRNA表達(dá)下降或缺失。其mRNA的表達(dá)量用組織中的mRNA的D值與內(nèi)參D值的比值表示，結(jié)果顯示乳腺癌組織BRCA1 mRNA表達(dá)量(0.16±0.08)明顯低于乳腺癌旁組織表達(dá)量(0.41±0.09)及乳腺良性病變組織表達(dá)量(0.69±0.14)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

2.2 BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

乳腺良性病變組織中未發(fā)現(xiàn)BRCA1甲基化，BRCA1基因在31例乳腺癌及癌旁組織中甲基化檢出率分別為29.0%(9/31)和3.2%(1/31)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.631，P＜0.05，圖2)。BRCA1甲基化與散發(fā)性乳腺癌組織學(xué)分級(jí)、E R陰性有關(guān)(P＜0.05)，但與發(fā)病年齡、組織分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05，表2)。

2.3 BRCA1 mRNA表達(dá)與其甲基化的關(guān)系

在18例BRCA1 mRNA表達(dá)陰性的乳腺癌組織中，有8例BRCA1基因發(fā)生了甲基化，在13例BRCA1 mRNA表達(dá)陽性的乳腺癌組織中有1例BRC A1基因發(fā)生甲基化，兩者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.949，P＜0.05)。

表 1 所用引物序列Tab.1 Primer sequences and PCR conditions

2.4 MS mRNA的表達(dá)與乳腺癌的關(guān)系

乳腺良性病變組織中MS mRNA有表 達(dá)，乳腺癌組織及癌旁組織中MS mRNA低表達(dá)或缺失(圖3)，其mRNA的表達(dá)量用 組 織中的mRNA的D值與內(nèi)參D值的比值表示。結(jié)果顯示，乳腺癌組織的表達(dá)量(0.26±0.06)明顯低于乳腺良性病變組織的MS mRNA表達(dá)量(0.60±0.21)及癌旁組織的表達(dá)量(0.40±0.13)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

表 2 乳腺癌組織BRCA1甲基化與臨床資料的關(guān)系Tab.2 Relationship between BRCA1 methylation in breast cancer tissues and clinical features

2.5 MS基因表達(dá)與BRCA1基因甲基化的關(guān)系

MS基因表達(dá)陰性的14例乳腺癌組織中，有7例BRCA1基因發(fā)生了甲基化；MS基因表達(dá)陽性的17例乳腺癌組織中，有2例其BRCA1發(fā)生甲基化，經(jīng)Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中MS mRNA的表達(dá)與BRCA1基因甲基化有相關(guān)性(r=0.419，P＜0.05)。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康。BRCA1基因主要功能是在細(xì)胞增殖周期的整個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)細(xì)胞分裂和生長進(jìn)行調(diào)控，使細(xì)胞按照正常程序周期性分 裂、生長和凋亡［9-10］，是重要的乳腺癌抑癌基因。抑癌基因失活可以導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，細(xì)胞發(fā)生異常增殖而癌變。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到BRCA1基因在乳腺癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織及乳腺良性病變組織，提示該基因的失表達(dá)與乳腺癌患病密切相關(guān)。大量研究已證實(shí)甲基化是除基因突變和缺失以外導(dǎo)致抑癌基因失活的第三種機(jī)制，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用。研究已發(fā)現(xiàn)許多抑癌基因通過DNA異常甲基化引起表達(dá)抑制甚至關(guān)閉而失活，如Rb、APC、MGMT、P16等。我們檢測(cè)到BRCA1基因乳腺癌組織甲基化檢出率為29%，這與之前報(bào)道的用不同方法檢測(cè)到9%～44%的乳腺癌樣本中BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化結(jié)果較一致，癌組織甲基化檢出率顯著高于相應(yīng)癌旁組織(3.2%)及乳腺良性病變組織(0)［11-12］。曾有報(bào)道提出，BRCA1基因甲基化的腫瘤可能表型模擬家族BRCA1基因腫瘤［13］。我們觀察到BRCA1甲基化與散發(fā)性乳腺癌組織學(xué)分級(jí)、ER負(fù)性有關(guān)，這與Birgisdottir等［5］報(bào)道的結(jié)果相一致。然而Matros等［6］報(bào)道BRCA1基因在高級(jí)別ER陽性腫瘤的啟動(dòng)子甲基化頻率高，這意味著其表型的關(guān)聯(lián)可能更加復(fù)雜。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，BRCA1基因的表達(dá)與該基因發(fā)生甲基化密切相關(guān)，DNA甲基化機(jī)制可以較合理地解釋散發(fā)性乳腺癌的BRCA1基因轉(zhuǎn)錄水平異常。

癌癥基因組學(xué)的顯著特點(diǎn)是全基因組的低甲基化，和特定位點(diǎn)的高甲基化并存。DNA低甲基化可以提高特定原癌基因(如與增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因)的表達(dá)，而特定位點(diǎn)高甲基化可以使抑癌基因(如DNA修復(fù)基因)的表達(dá)降低，從而增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)［14］，而啟動(dòng)這些變化的機(jī)制尚待研究?；騿?dòng)子區(qū)甲基化模式的改變，是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的途徑之一［15］。大量研究表明，正常細(xì)胞中抑癌基因啟動(dòng)子是低甲基化甚至非甲基化的。然而，腫瘤細(xì)胞中抑癌基因卻常發(fā)生甲基化，從而導(dǎo)致抑癌基因低表達(dá)和癌細(xì)胞增殖能力提高［16-18］。MS主要生化功能是催化同型半胱氨酸復(fù)甲基為甲硫氨酸，甲硫氨酸在轉(zhuǎn)甲基之前，與ATP作用生成SAM，為DNA的甲基化提供甲基，是參與甲基供體生成的關(guān)鍵酶。大量實(shí)驗(yàn)已證明MS多態(tài)性與乳腺癌患病有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)室也發(fā)現(xiàn)MS2756等 位基因G型突變能夠增加乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，并推測(cè)這可能與MS多態(tài)性的改變影響了酶的活性，從而影響了甲基供體生成，導(dǎo)致甲基化異常有關(guān)［19］。而本 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)到乳腺良性病變組織中MS mRNA均有表達(dá)，乳腺癌患者的癌組織及癌旁組織中MS低表達(dá)或缺失，提示MS基因低表達(dá)能增加乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn) 。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌組織中MS mRNA的表達(dá)與BRCA1基因甲基化有相關(guān)性，這表明MS基因的表達(dá)可能影響某些基因的甲基化狀態(tài)。我們推測(cè)MS基因低表達(dá)，會(huì)影響體內(nèi)甲基供體生成，導(dǎo)致甲基化異常，從而引起B(yǎng)RCA1基因低甲基化。但我們卻發(fā)現(xiàn)MS基因表達(dá)陰性癌組織中BRCA1基因發(fā)生甲基化的頻率較表達(dá)陽性的顯著升高，表明MS基因低表達(dá)與抑癌基因BRCA1甲基化有關(guān)，符合腫瘤細(xì)胞抑癌基因常常發(fā)生甲基化這一表觀遺傳學(xué)特征。Stempak等［20］、Kim 等［21］、Gaia等［22］研究表明，甲基供體缺乏對(duì)甲基化的影響是位點(diǎn)和基因特異性的，此外，甲基化的變化方向可能是細(xì)胞、靶器官、轉(zhuǎn)化具體階段特異性的，而且未必 是基因組和基因之間或位點(diǎn)的DNA甲基化相同。具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。近年來，DNA甲基化模式異常已被確立為人類癌癥的標(biāo)志之一。甲硫氨酸循環(huán)關(guān)鍵酶低表達(dá)，導(dǎo)致體內(nèi)甲基化水 平異常，抑癌基因CpG島高甲基化而失活，從而引發(fā)癌癥，我們得到的結(jié)果初步證實(shí)了這一假設(shè)。我們的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了甲硫氨酸循環(huán)對(duì)乳腺癌發(fā)病的重要性。雖然該循環(huán)酶網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，但評(píng)估限速酶及其與環(huán)境的相互作用對(duì)于評(píng)估乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)是十分關(guān)鍵的。

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