宋傳貴 傅芳萌 吳雪英 林舜國 王川

福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺外科，福建 福州 350001

早發(fā)性乳腺癌(發(fā)病年齡≤35歲)屬于具有遺傳傾向的乳腺癌人群，易感性基因BRCA1或BRCA2基因的胚系突變只能解釋其中10%的人群［1］，其余的則涉及到眾多低外顯易感基因位點［2］。MDM2基因為抑癌基因p53的負性調(diào)控因子，與p53協(xié)同調(diào)控細胞周期，保持基因組穩(wěn)定性［3］。近年來有研究表明，MDM2基因的SNP309 (T＞G，rs2279744)可能增加人群的散發(fā)性乳腺癌發(fā)病風險［4-5］。但各研究結(jié)果尚不一致，國內(nèi)尚無MDM2基因SNP309單核苷酸多態(tài)性在早發(fā)性乳腺癌(≤35歲)易感性中的作用的研究報道。為進一步明確其可能的易感效應(yīng)，本研究選擇福建地區(qū)早發(fā)性乳腺癌患者為研究對象，探討MDM2rs2279744多態(tài)性位點基因型的分布及是否可以作為乳腺癌的低外顯率易感基因位點的可能性。

1 資料和方法

1.1 資料來源

1.1.1 研究對象

病例為福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院2006年1月—2010年6月無血緣關(guān)系的福建地區(qū)漢族123例原發(fā)性乳腺癌患者，全部經(jīng)組織病理證實，家族史狀況由病史或調(diào)查表獲得，并最后經(jīng)本人證實。病例組均為單純早發(fā)性乳腺癌患者，無明顯家族史，發(fā)病年齡≤35歲。入組患者年齡21～35歲，中位年齡31.7歲。平均初潮年齡為(15.0±1.5)歲。對照組101例為健康女性，年齡20～39歲，中位年齡33.01歲，平均初潮年齡為(14.0±1.6)歲，按年齡與研究對象配對(年齡±4歲)入組。年齡以及初潮年齡兩組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.023，P＜0.01)。

1.1.2 標本

獲得患者知情同意后，抽取外周靜脈血5 mL置于含800 μL酸性枸櫞酸葡萄糖(ACD)抗凝液的試管中備用。

1.1.3 主要試劑和儀器

FlexiGene DNA提取試劑盒(美國Qiagen公司)，GeneAmp?9700 PCR 系統(tǒng)(美國ABI公司)，HotStar Taq聚合酶(5 U/μL)及試劑盒(美國Qiagen公司)，MassARRA YTM Analyzer(美國Sequenom公司)。

1.2 方法

1.2.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法

步驟方法參考文獻［6-7］(與深圳華大基因組研究中心合作完成)：⑴DNA提取 從外周血提取基因組DNA，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＂芇CR擴增 引物如下：1st-PCRP：5’-ACGTTGGATGAGTTCAGGGTAA AGGTCACG-3’，2nd-PCRP：5’-ACGTT GGATGTCACACTAGTGACCCGACAG-3’， UEP序列：5’-GGACCTCCCGCGCCG-3’。PCR反應(yīng)體系總體積為5 μL，其中各種引物濃度為0.1 μmol/L，各種dNTP濃度為0.25 μmol/ L，MgCl2濃度為1 mmol/L，Taq多聚酶(Invitrogen)1.25 U，DNA 模板2.5 ng。PCR反應(yīng)的條件為95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個循環(huán)；72 ℃終延伸3 min，然后4 ℃保存。隨后純化PCR產(chǎn)物進行延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)體系總體積9 μL，PCR純化產(chǎn)物7 μL，延伸混合液2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性5 min，52 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，55個循環(huán)；72 ℃終延伸3 min，產(chǎn)物于4 ℃保存。每個延伸反應(yīng)用3 mg Clean Resin樹脂純化后于384孔Specter CHIP芯片上點樣。使用MassARRA YTM Analyzer質(zhì)譜檢測，運行MassARRA YTM Typer 3.0.1軟件進行數(shù)據(jù)分析，并輸出各樣本相應(yīng)位點的基因型。

1.2.2 基因型的判斷

各樣本經(jīng)PCR反應(yīng)及質(zhì)譜檢測，檢測位點就生成特征性峰值圖，通過判斷其特征性峰值圖，就可得出其相應(yīng)的堿基。各位點的代表性圖譜見圖1。

1.3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗進行各基因型和等位基因頻率在病例組和對照組間的分布差異比較以及Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗；兩組間的流行病學資料均數(shù)間比較采用t檢驗；相對危險度采用比值比(odd ratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)并應(yīng)用非條件Logistic回歸分析計算，并對混雜因素進行校正。所有統(tǒng)計采用雙側(cè)概率檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 病例對照組間流行病學特征比較

病例組的年齡小于對照組的年齡，對照組初潮年齡低于病例組的初潮年齡(P＜0.05)，所以在計算OR時需要予以校正。

2.2 基因型鑒定

MDM2基因rs2279744各基因型采用時間飛行質(zhì)譜分析鑒定(圖1)，結(jié)果共123例病例和101例對照PCR成功進行分型。

2.3 MDM2基因SNP309 基因型分布

正常對照組中MDM2基因rs2279744 TT、TG及GG基因型的頻率分別為28(27.7%)、50(49.5%)和23(22.8%)；經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，均符合遺傳平衡(P＞0.05)，表明其具有群體代表性。病例組rs2279744 TT、TG及GG基因型的頻率分別為26(21.1%)、61(49.6%)和36(29.3%)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.389，表1)。

2.4 SNP309基因型與乳腺癌發(fā)病風險的關(guān)系

分別以rs2279744 TT基因型為參照，非條件Logistic回歸分析結(jié)果提示，不管TG ［1.216(95%CI：0.604～2.445)］或是GG［1.326(95%CI：0.869～2.024)］還是TG+GG［1.358(95%CI：0.706～2.614)］都提高了患乳腺癌的發(fā)病危險，但差異均未達到統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。

3 討 論

MDM2基因為p53的上游基因，可以負性抑制p53基因抑癌功能的表達，SNP309 (T＞G)為功能性多態(tài)，位于基因的啟動子區(qū)，可以上調(diào)MDM2蛋白表達，從而抑制p53及其下游通路的抑癌功能，某些研究表明T＞G的轉(zhuǎn)換增加了乳腺癌的發(fā)病風險。在江蘇人群的研究中，Ma等［5］的研究中605例對照中MDM2基因各基因型的頻率結(jié)果(TT 24%、TG 50.9%、GG 25.1%)與本研究101例對照的結(jié)果相似(TT 27.7%、TG 49.5%、GG 22.8%)，其中，GG基因型比例明顯低于新加坡人群(44例對照，34.1%)［4］；說明中國大陸人群與新加坡的華裔人群的地域特征和遺傳特征已有不同。Logistic回歸分析表明，本研究MDM2基因的多態(tài)性位點SNP309(GGvsTT或GG+TGvsTT)在病例組中的分布相對于對照人群有增高趨勢，但都未顯著性的提高早發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風險。這與在散發(fā)性乳腺癌的研究基本相似［5,8］，表明該多態(tài)性位點對乳腺癌的易感效應(yīng)相對微弱。相對于上海人群中進行的乳腺癌研究，Lum等［4］發(fā)現(xiàn)MDM2基因的SNP309 G等位基因增加總體乳腺癌的發(fā)病風險達2.68 (1.54～4.69)倍；但是在早發(fā)性散發(fā)性乳腺癌(＜40歲)亞組中，SNP309多態(tài)性G基因型對乳腺癌發(fā)病風險為1.53 (0.68～3.45)，這與本研究結(jié)果相似，說明在早發(fā)乳腺癌人群中SNP309的效應(yīng)作用較小，可被其他易感基因所掩蓋。

表 1 MDM2 SNP309多態(tài)性基因型分布及其與乳腺癌發(fā)病風險的關(guān)系Tab.1 Genotype distribution of SNP 309 of MDM2 gene and its association with risk of breast cancer

我們的研究與前面的研究不同之處在于，本研究的例數(shù)相比散發(fā)乳腺癌人群要少，可能存在著選擇偏差，但由于我們的研究對象為具有遺傳傾向的早發(fā)性乳腺癌(發(fā)病年齡≤35歲)，更能體現(xiàn)基因的易感效應(yīng)，所以偏差可以得到一定程度的糾正。對比在中國臺灣的散發(fā)性乳腺癌研究(124病例，平均年齡54歲；97例對照，平均年齡38歲)，本研究(123病例，平均年齡31.78歲；101例對照，平均年齡33.01歲)的結(jié)果值得探討［9］。

從遺傳基因組學分析，MDM2基因SNP309多態(tài)性位點可以影響基因的轉(zhuǎn)錄過程和蛋白產(chǎn)物的表達，但其實際的遺傳學效應(yīng)尚不明確；其二是否其潛在影響被其他未鑒定的相對高外顯易感基因位點所覆蓋尚需考證。

總之，本研究結(jié)果認為，MDM2基因SNP309多態(tài)性在中國大陸人群中有其自身的分布特點，可能與福建地區(qū)早發(fā)性乳腺癌(≤35歲)的遺傳易感性無明顯關(guān)聯(lián)，尚不能作為低外顯率的乳腺癌易感基因位點。明確MDM2基因遺傳多態(tài)性位點在中國人群中的確切作用，還需要更大樣本的遺傳傾向乳腺癌的流行病學研究確認。

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