王玲 單保恩 張建彬

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所免疫室， 河北 石家莊 050011

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是近些年學(xué)者提出的一個(gè)新的乳腺癌亞型，該類乳腺癌具有發(fā)病年齡早、預(yù)后差、極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，其中超過70%的病例在明確診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，成為死亡的主要原因［1-2］。由于內(nèi)分泌治療和針對(duì)Her-2的靶向治療對(duì)TNBC無效，至今對(duì)TNBC仍缺乏令人滿意的綜合治療方案。因此，TNBC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是目前治療TNBC中亟待解決的問題。

塞來昔布(celecoxib)是一種新型非甾體類抗炎藥，選擇性抑制環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)，而對(duì)COX-1沒有抑制作用［3-4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布具有很好的抗腫瘤活性，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移［5-7］。我們前期的研究資料顯示，塞來昔布可以抑制人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯［8-9］，但關(guān)于塞來昔布是否對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲行為產(chǎn)生影響目前還不清楚。為此，本研究以體外培養(yǎng)的人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231為研究對(duì)象，觀察塞來昔布對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞黏附、遷移以及侵襲能力的影響。評(píng)價(jià)塞來昔布用于臨床TNBC治療的可能性，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和方法學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫上海保藏中心。胎牛血清購自杭州四季青公司。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Sigma公司。塞來昔布購自美國輝瑞有限公司。Matrigel膠購自美國BD Bioscience公司。Transwell侵襲小室購自美國Costar公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，細(xì)胞生長呈70%～80%融合狀態(tài)時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔日換液，每3～4天傳代一次。塞來昔布溶解于DMSO，使用前用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋到所需的濃度，其中DMSO終濃度＜0.1%。實(shí)驗(yàn)分為溶劑對(duì)照組和藥物干預(yù)組。以0.1%終濃度的DMSO作為溶劑對(duì)照組。藥物干預(yù)組塞來昔布終濃度分別為0、40、80、120 μmol/L。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長期MDAMB-231細(xì)胞，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求收集細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)時(shí)取出預(yù)冷好的Matrigel膠，用無血清DMEM培養(yǎng)基將Matrigel稀釋成0.04 g/L備用，96孔培養(yǎng)板中每孔2 μg，37 ℃無菌風(fēng)干過夜。每孔加入適量的無血清DMEM培養(yǎng)基，放置30 min，洗去多余的膠。取經(jīng)過0、40、80、120 μmol/L塞來昔布處理24 h的MDA-MB-231細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種在鋪膠的96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔的平行對(duì)照。置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)2 h后，然后每孔加入MTT 20 μL (5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μL，在振蕩器上震蕩10 min，然后在酶標(biāo)儀490 nm波長處讀取吸光度值(D)。以對(duì)照組細(xì)胞D值為參考，計(jì)算經(jīng)塞來昔布處理后細(xì)胞相對(duì)黏附率。相對(duì)黏附率(%)=(D實(shí)驗(yàn)組/D對(duì)照組)×100%。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，以2×105mL-1接種于24孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞長至80%左右融合時(shí)，更換無血清的DMEM，培養(yǎng)細(xì)胞24 h，用來饑餓細(xì)胞。待細(xì)胞長到完全融合時(shí)，用10 μL加樣槍頭在每孔單層細(xì)胞上劃痕，造成培養(yǎng)細(xì)胞劃痕模型。劃痕后用PBS沖洗2遍。沿劃痕邊緣等距離間隔做上標(biāo)記，以便檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分組同前，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，定時(shí)用倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合程度并拍照。計(jì)算越過0 h劃痕邊界的細(xì)胞數(shù)，并與對(duì)照組越過劃痕的細(xì)胞數(shù)相比計(jì)算百分率，以此反映細(xì)胞的平面遷移能力。以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用帶有8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室，將Matrigel (50 mg/L)膠和無血清DMEM培養(yǎng)基以1∶3比例進(jìn)行稀釋。在小室上室鋪100 μL稀釋好的Matrigel膠，37 ℃無菌保持過夜，確保Matrigel膠充分聚合。收集對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105mL-1，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液于上室，用DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充至1 mL。下室加入預(yù)先培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞24 h后的上清液，每孔600 μL。實(shí)驗(yàn)分組同前。孵育約24 h后，取出上室。用棉簽頭擦掉Matrige膠及膠上細(xì)胞，PBS液洗3次。24孔板中加入500 μL含5 g/L MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37 ℃、4 h后取出。24孔板中加入500 μL DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10 min，使MTT充分溶解。取出小室，于酶標(biāo)儀上測(cè)D值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 RT-PCR檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) MMP-2及MMP-9 mRNA表達(dá)水平

按1.2實(shí)驗(yàn)分組，取對(duì)數(shù)生長期的MDAMB-231細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行RNA完整性及純度的鑒定。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成cDNA。以β-actin 為內(nèi)參照，β-actin的產(chǎn)物長度為838 bp，擴(kuò)增β-actin引物序列：上游引物5’-ATCTGGCAC CACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’，下游引物5’-CGTCATCCCTGCTTGCTGATCCA CATCTGC-3’。擴(kuò)增MMP-2引物序列：上游引物5’-GGATGATGCCTTTGCTCG -3’，下游引物5’-CAGTGGACATGGCGGTCT-3’，預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為590 bp。擴(kuò)增MMP-9引物序列：上游引物5’-AACTCACGCGCCAGTAGAAG-3’，下游引物：5’-GAGGTGGACCGGATGTTCC-3’，預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為105 bp。

β-actin反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，32個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，4 ℃終止。MMP-2反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性60 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，4 ℃終止。MMP-9反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，4 ℃終止。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，直接加樣于1.5%瓊脂糖凝膠加樣孔中，80 V電壓，電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)分析并拍攝圖像，采用Gel-Pro Analyzer 3.1分析軟件分析條帶灰度值，mRNA表達(dá)相對(duì)值=目的片段灰度值/β-actin灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較用t檢驗(yàn)，兩組以上數(shù)據(jù)比較用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 塞來昔布對(duì)人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231黏附能力的影響

結(jié)果顯示，經(jīng)80、120 μmol/L塞來昔布作用24 h后，MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的相對(duì)黏附率分別為(50.2±7.3)%、(31.5±2.2)%，與未經(jīng)塞來昔布處理的對(duì)照組細(xì)胞相對(duì)黏附率［(96.8±10.9)%］相比明顯減少(P＜0.05)。說明塞來昔布能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的黏附力。

2.2 塞來昔布對(duì)人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞24 h后向劃痕邊緣爬行的速度快，細(xì)胞鋪展迅速，劃痕的寬度明顯變窄，有些細(xì)胞已經(jīng)爬行至劃痕的中央。而經(jīng)40、80、120 μmol/L塞來昔布作用后，細(xì)胞向劃痕邊緣爬行的速度明顯減慢，劃痕缺損處修復(fù)緩慢。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，80和120 μmol/L實(shí)驗(yàn)組越過劃痕的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。提示隨著塞來昔布藥物濃度的增加，細(xì)胞的平面運(yùn)動(dòng)能力明顯下降。

2.3 塞來昔布對(duì)人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231侵襲能力的影響

Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過塞來昔布處理后，通過人工基底膜的MDA-MB-231細(xì)胞的D值明顯降低。80和120 μmol/L塞來昔布作用后透過人工基底膜細(xì)胞的D值分別為0.561±0.072、0.318±0.056，與對(duì)照組(0.927±0.102)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)?？梢娙麃砦舨紝?duì)MDAMB-231細(xì)胞體外的侵襲力具有很強(qiáng)的抑制作用，且呈劑量依賴性。

2.4 塞來昔布對(duì)人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231 MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度(終濃度40、80、120 μmol/L)塞來昔布處理24 h后，MDA-MB-231細(xì)胞MMP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.32±0.09、0.25±0.06和0.09±0.03，顯著低于對(duì)照組(0.48±0.12)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)；MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.41±0.05、0.28±0.03和0.13±0.02，其中80、120 μmol/L組顯著低于對(duì)照組(0.47±0.06)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

3 討 論

TNBC相對(duì)于其他類型的乳腺癌亞型而言，具有更高的侵襲和轉(zhuǎn)移特性，給治療帶來了極大的困難，每年都有大量患者因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡［10-11］。人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231是一種高侵襲性、分化差、生長倍增速度快的乳腺癌細(xì)胞，經(jīng)常被用來建立人TNBC的裸鼠模型［12］。本實(shí)驗(yàn)我們選取該細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察塞來昔布對(duì)該細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

目前研究認(rèn)為，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移主要分為三步，細(xì)胞與基底膜的黏附、細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞的遷移［13-14］。因此，細(xì)胞與基底膜的黏附是腫瘤發(fā)生侵襲的前提和必要條件。本研究塞來昔布能抑制MDA-MB-231細(xì)胞的黏附，并呈劑量依賴性。在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤細(xì)胞必須穿過血管、淋巴管的基底膜才能進(jìn)入血管和淋巴管，達(dá)到轉(zhuǎn)移的目的。因此，腫瘤細(xì)胞受趨化因素趨化并穿過基底膜的能力是侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一。我們采用正常培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞24 h的培養(yǎng)上清液作為趨化因素、Matrigel作為人工基底膜，通過Transwell侵襲小室觀察腫瘤細(xì)胞侵襲人工基底膜情況。結(jié)果顯示，用40 μmol/L塞來希布處理細(xì)胞24 h，細(xì)胞的體外趨化運(yùn)動(dòng)能力開始降低，但與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而80、120 μmol/L塞來昔布可以顯著地抑制細(xì)胞體外穿越人工基底膜的能力，減少細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)。腫瘤細(xì)胞與母體瘤分離，侵襲周邊正常組織時(shí)，需要一定的運(yùn)動(dòng)能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)塞來昔布作用后，細(xì)胞向劃痕中央遷移的速度明顯減慢，高劑量組藥物顯示對(duì)細(xì)胞遷移能力具有明顯抑制作用，并呈劑量-效應(yīng)依賴性。最新的研究報(bào)道，塞來昔布可以抑制胰腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、食管鱗癌等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲［15-17］。本部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，塞來昔布可以顯著地抑制人TNBC細(xì)胞MDA-MB-231的運(yùn)動(dòng)及侵襲能力，提示塞來昔布可能有利于防治TNBC的早期轉(zhuǎn)移。

MMPs是腫瘤細(xì)胞侵襲周邊正常組織中最為重要的一組蛋白酶。某些因素使MMPs在腫瘤細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，當(dāng)其表達(dá)大于其抑制劑TIMPs時(shí)，這種平衡發(fā)生改變，會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)降解，腫瘤易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移［18-19］。多項(xiàng)研究已證實(shí)，MMP-2和MMP-9高表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在發(fā)生早期轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中，這兩種蛋白酶的表達(dá)增高更為明顯［20-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布可以不同程度地降低MDA-MB-231細(xì)胞MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄水平抑制腫瘤細(xì)胞酶的表達(dá)作用，防止過量的MMP集聚在細(xì)胞周圍，阻斷腫瘤細(xì)胞為其自身轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。但關(guān)于塞來昔布對(duì)MMP-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)機(jī)制，我們還在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究中。

本研究的結(jié)果表明，塞來昔布可以抑制人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231體外黏附、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，具有潛在的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能；這一功能可能與塞來昔布能降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)MMP-2和MMP-9基因的表達(dá)有關(guān)。以上結(jié)果為臨床上塞來昔布防治TNBC的轉(zhuǎn)移提供了理論依據(jù)。

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