洪偉俊 寧允葉 胥武劍 邵艷 李強

第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200433

肺癌是死亡率極高的惡性腫瘤，其中80%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，只有20%～30%的患者有手術(shù)機會，但是即使是在手術(shù)切除的早期NSCLC患者中，也有三分之二的患者存在復發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險，5年生存率仍然較低(8%～14%)。叢蕾等［1］研究發(fā)現(xiàn)，晚期NSCLC患者單純化療后中位生存期僅為12.2個月，1年生存率只有52.9%，復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導致死亡的主要因素。目前針對肺癌的主要治療手段——放療、化療等對提高肺癌患者的生存率已達到一個平臺期，深入探討肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學機制，以尋找新的安全有效的治療途徑、改善預后成為腫瘤研究的熱點。

組蛋白乙?；癄顟B(tài)是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵，而組蛋白乙酰化水平受組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)和組蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases，HATs)調(diào)節(jié)，HDACs和HATs失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要分子機制。組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 5，HDAC5)是Verdel等［2］于1999年在小鼠基因組中發(fā)現(xiàn)的。人HDAC5基因定位于染色體17q21，廣泛表達于肺、腦、心肌、骨骼肌、胎盤等多種組織。HDAC5在多種腫瘤中表達降低，但其在肺癌細胞遷移中的作用尚未見報道。本研究旨在檢測肺癌組織及其相對應的癌旁組織中HDAC5基因表達情況；體外利用HDAC5基因過表達質(zhì)粒，研究HDAC5對肺腺癌細胞NCI-H1299遷移的影響。

1 資料和方法

1.1 患者一般資料

所有標本均來自我院2009年4月—2009年11月間手術(shù)的NSCLC患者，其中男性15例，女性13例；腺癌20例，鱗癌8例；年齡41～70歲，平均年齡為57.8歲。在手術(shù)切除病灶后用鋒利刀片迅速切取原發(fā)腫瘤和距離切緣2 cm處癌旁組織各1塊，組織標本凍存于液氮中。

1.2 主要試劑

NCI-H1299細胞(購自中國科學院上海細胞所)；胎牛血清(Hyclone)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)、OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基(Gibco)；兔抗人-HDAC5(SAB)；辣根過氧化酶(HRP)標記的兔抗人GAPDH抗體(康成生物)；HRP標記的山羊抗兔IgG(Abcam)；RNA提取試劑盒(TRIzol)(Invitrogen)，RT-PCR試劑盒(Takara)，real time-PCR試劑盒(Takara)；HDAC5野生型基因質(zhì)粒(pDEST26-HDAC5wt)由澳大利亞迪肯大學Sean L.McGee教授惠贈。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

NCI-H1299細胞貼壁生長于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、相對濕度為90%的溫箱(Heraus)內(nèi)培養(yǎng)，當細胞融合達80%以上時0.25%胰酶消化傳代。

1.3.2HDAC5基因轉(zhuǎn)染及篩選

將NCI-H1299細胞接種于24孔板中，每孔為5×105個細胞，細胞融合至80%以上，用Fugene HD試劑盒進行轉(zhuǎn)染。實驗分組：轉(zhuǎn)染HDAC5wt基因的實驗組(HDAC5wt)、未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的正常對照組(control)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的陰性對照組(vector)。用OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒DNA至濃度為：2 μg DNA/100 μL OPTIMEMⅠ培養(yǎng)基，分別以Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑：DNA比例為2∶2、4∶2、6∶2配制轉(zhuǎn)染復合物，室溫下溫育15 min，將轉(zhuǎn)染復合物加入到培養(yǎng)細胞中，OPTI-MEM Ⅰ培養(yǎng)6～8 h后換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細胞提取蛋白。再以選定的最佳轉(zhuǎn)染比例轉(zhuǎn)染NCI-H1299細胞，36 h時加入含1 000 μg/mL G418和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)，3周后篩選出陽性克隆擴增培養(yǎng)，并用500 μg/mL的G418維持篩選。

1.3.3 凍存組織處理

于液氮中取出標本，剪取少許組織并加入液氮后快速研磨，收集于2 mL EP管，分別加入TRIzol及RIPA蛋白裂解液后勻漿，提取mRNA、蛋白質(zhì)，分別進行real time RT-PCR、Western blot實驗。

1.3.4 Real time RT-PCR檢測HDAC5 mRNA表達

用TRIzol法抽提總mRNA，測定其濃度和純度，用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR擴增。HDAC5上游引物：5’-CCATCAGCCAGAAGATGTATGC-3’，下游引物： 5’-ATTCCTCGGCGTGGTGTCCT-3’，PCR產(chǎn)物201 bp；β-actin上游引物：5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’，下游引物： 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’，PCR產(chǎn)物 234 bp。PCR條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

1.3.5 Western blot檢測HDAC5蛋白

RIPA蛋白裂解液裂解細胞及組織，4 ℃、134 000×g離心20 min，取上清液即為蛋白提取物。用BCA法測定蛋白濃度，30 μg變性蛋白聚丙烯酰胺(PAGE，10%)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉，1∶1 000一抗4 ℃過夜，1∶2 000山羊抗兔HRP標記二抗室溫反應1 h ，ECL顯色，成像。

1.3.6 MTT比色法測定細胞增殖

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的H1299細胞(HDAC5wt)、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞(vector)、未轉(zhuǎn)染細胞(control)融合達80%以上時，胰酶消化后形成單細胞懸液，以每孔5 000個細胞接種于 96孔板中，每組設(shè)10個復孔，分別于第1～5天時檢測細胞增殖情況。細胞貼壁后進行初始490 nm波長光下的吸光度(D490)測定，之后分別于第1～5天分別測定各組細胞的D490值：每孔加入100 μL MTT液培養(yǎng)4 h后，去除培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，室溫下充分震蕩10 min，用酶標儀測定D490。重復3次。

1.3.7 Transwell實驗

分別將已融合至80%以上的3組細胞進行胰酶消化，形成單細胞懸液，872×g離心5 min后以無血清培養(yǎng)基重懸細胞，取200 μL無血清單細胞懸液(2×105個細胞)接種至置于24孔板內(nèi)的8 μm PET膜的transwell 小室中，外室中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，溫箱中溫育8 h取出，中性甲醛固定30 min，用棉簽小心擦去上層未遷移細胞，用瑞氏染色、拍照，鏡下計數(shù)6個視野中已跨膜遷移的細胞數(shù)目。

1.3.8 劃痕實驗

以每孔2×106個細胞接種于6孔板中，當細胞融合達90%～100%時，棄去培養(yǎng)基，以無菌PBS清洗細胞1次后，用200 μL槍頭沿孔直徑筆直劃痕，用無菌PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)，分別在0、12、24 h觀察、拍照。

1.4 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)用表示，應用SPSS 11.5軟件包進行統(tǒng)計學分析，兩樣本均數(shù)間比較采用配對t檢驗，組間差異采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，差異顯著者采用LSD-t檢驗進行兩組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HDAC5在肺癌組織標本中的表達

Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，28例組織標本中有20例肺癌組織中HDAC5 mRNA表達低于癌旁組織，其余8例HDAC5 mRNA表達稍微升高或無明顯差異(圖1)。Western blot檢測NSCLC及癌旁組織HDAC5蛋白表達情況，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，肺癌組織中HDAC5的蛋白表達明顯降低(圖2)，其表達趨勢與mRNA表達一致，提示HDAC5在NSCLC中的低表達可能與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

2.2 體外細胞轉(zhuǎn)染中轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例篩選

分別以Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒比例為 2∶2、4∶2、6∶2配制轉(zhuǎn)染復合物，轉(zhuǎn)染NCI-H1299細胞，如圖3所示，3種比例的轉(zhuǎn)染試劑都成功將HDAC5wt基因轉(zhuǎn)入目的細胞，其中4∶2組轉(zhuǎn)染效率明顯高于2∶2組，即前者HDAC5蛋白表達量高于后者；而6∶2組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，HDAC5蛋白表達量與4∶2組相近。因此，采用Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒=4∶2的轉(zhuǎn)染比例進行后續(xù)相關(guān)研究。

2.3 基因過表達鑒定

分別將HDAC5wt質(zhì)粒及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入NCI-H1299細胞后，用G418進行篩選，形成穩(wěn)定表達株。與未轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒組相比，HDAC5wt組細胞中HDAC5的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高(圖4)，蛋白表達量明顯增加(圖5)。

2.4 HDAC5基因?qū)1299細胞增殖的影響

采用MTT法檢測control、vector、HDAC5wt質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3組細胞增殖情況，細胞貼壁后3組細胞初始D490值無統(tǒng)計學差異，表明3組細胞接種數(shù)量一致。在24 h時，3組間D490無統(tǒng)計學差異；在第2～5 天對數(shù)生長期內(nèi)實驗組細胞D490值較正常對照組及陰性對照組顯著降低，而正常對照組與陰性對照組之間D490在同一檢測時間點無顯著性差異(圖6)。

2.5 HDAC5過表達對H1299細胞遷移的影響

我們采用Transwell檢測HDAC5基因?qū)1299細胞跨膜遷移能力的影響。結(jié)果顯示，實驗組(158.3±19.4)跨膜遷移細胞數(shù)顯著低于正常對照組(247.0±12.1)及陰性對照組(236.0±14.9，P均＜0.05)，而正常對照組與陰性對照組間穿膜細胞數(shù)無顯著差異，提示HDAC5過表達抑制了NCI-H1299細胞跨膜遷移能力。

同時，我們采用劃痕實驗直觀地觀察HDAC5基因?qū)1299細胞遷移能力的影響。結(jié)果如圖7所示，與初始劃痕寬度相比，在24 h內(nèi)3組細胞的劃痕都有不同程度的愈合。HDAC5組細胞在24 h時劃痕愈合程度明顯低于其他兩組，表明該組細胞的遷移能力低于其他兩組，從另一個角度證實了HDAC5基因過表達抑制NCI-H1299細胞遷移。

3 討 論

HDACs和HATs在腫瘤細胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。HDACs使組蛋白去乙酰化后恢復帶正電荷的特性，并與帶負電的DNA緊密結(jié)合，染色質(zhì)呈致密卷曲的阻抑結(jié)構(gòu)，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄；HATs通過在組蛋白的N-端賴氨酸殘基上引入乙?；?，促進基因轉(zhuǎn)錄。兩者在體內(nèi)處于一個動態(tài)平衡，共同參與基因的表達調(diào)控。一旦這種平衡破壞，細胞便異常增殖、分化，最終導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。HDACs在不同腫瘤中存在差異性表達，其中大多數(shù)亞型在多種腫瘤中呈高表達狀態(tài)：HDAC1在肺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和乳腺癌中高表達［3］，HDAC2在胃癌、結(jié)直腸癌和宮頸癌中高表達［4-5］；目前僅發(fā)現(xiàn)HDAC5在多種腫瘤中低表達。Osada等［6］報道HDAC5基因表達與NSCLC預后顯著相關(guān)，HDAC5表達降低的患者其預后較差。本研究檢測了HDAC5在28例NSCLC組織及相應癌旁組織中的表達，結(jié)果證實HDAC5在癌組織較對應的癌旁組織表達明顯降低，提示HDAC5基因的低表達可能在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Urbich等［7］的研究表明HDAC5抑制血管形成，因此推測HDAC5可能與肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。

將HDAC5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人肺腺癌細胞NCI-H1299，分別采用Transwell方法研究細胞跨膜遷移能力、采用劃痕方法研究細胞側(cè)向遷移能力，結(jié)果表明，HDAC5基因過表達抑制H1299細胞遷移。由于在24 h時過表達HDAC5基因并未影響H1299細胞的增殖能力，因此排除了細胞遷移研究中因過表達HDAC5基因后細胞增殖差異對跨膜遷移細胞量及劃痕愈合能力的影響，從而證實HDAC5基因抑制H1299細胞遷移。

HDAC5蛋白上有多個基序：核定位信號基序(NLS)、出核信號基序(NES)、C-末端結(jié)合蛋白基序(CtBP)、肌增強子2結(jié)合基序(MEF2)、14-3-3伴侶蛋白結(jié)合基序、酶活性區(qū)域(DAC)等，HDAC5在不同的生理病理過程中發(fā)揮不同作用，參與這一過程的基序有所差異。HDAC5被磷酸化后可以在細胞核和細胞質(zhì)之間穿梭運動。Urbich、Roy等［7-8］研究表明，HDAC5及其磷酸化后的核定位在腫瘤細胞的增殖、血管內(nèi)皮細胞的遷移過程中起重要作用。而多種因素參與或影響HDAC5的磷酸化及其核質(zhì)轉(zhuǎn)運過程，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、Ga13蛋白、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、流體剪切力等［9-11］。然而HDAC5抑制NCI-H1299細胞遷移是否與其磷酸化后的核定位或核質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)尚需進一步探討。

綜上，本研究結(jié)果顯示HDAC5基因在NSCLC中低表達；HDAC5基因過表達后抑制H1299細胞遷移，提示HDAC5基因可能參與NSCLC的轉(zhuǎn)移，為NSCLC患者晚期轉(zhuǎn)移的防治提供一種新的思路，為抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移提供一個新的靶點。

［1］叢蕾, 崔言剛, 王濰博.晚期非小細胞肺癌化療預后因素的COX回歸分析［J］.中國癌癥雜志, 2009, 19(4): 280-283.

［2］Verdel A, Khochbin S.Identification of a new family of higher eukaryotic histone deacetylases.Coordinate expression of differentiation dependent chromatin modifiers ［J］.J Biol Chem, 1999, 274(4): 2440-2445.

［3］Halkidou K, Gaughan L, Cook S, et al.Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer ［J］.The Prostate, 2004, 59(2): 177-189.

［4］Huang BH, Laban M, Leung CH, et al.Inhibition of histone deacetylase 2 increases apoptosis and p21Cip1/WAF1 expression，independent of histone deacetylase 1 ［J］.Cell death and differentiation, 2005, 12(4): 395-404.

［5］Hrzenjak A, Moinfar F, Kremser ML, et al.Valproate inhibition of histone deacetylase 2 affects differentiation and decreases proliferation of endometrial stromal sarcoma cells［J］.Molecular cancer therapeutics, 2006, 5(9): 2003-2010.

［6］Osada H, Tatematsu Y, Saito H, et al.Reduced expression of class II histone deacetylase genes is associated with poor prognosis in lung cancer patients ［J］.Int J Cancer, 2004,112(1): 26-32.

［7］Urbich C, R?ssig L, Kaluza D, et al.HDAC5 is a repressor of angiogenesis and determines the angiogenic gene expression pattern of endothelial cells ［J］.Blood, 2009, 113(22):5669-5679.

［8］Roy S, Shor AC, Bagui TK, et al.Histone Deacetylase 5 Represses the Transcription of Cyclin D3 ［J］.J Cell Biochem, 2008, 104(6): 2143-2154.

［9］Ha CH, Wang W, Jhun BS, et al.Protein kinase D-dependent phosphorylation and nuclear export of histone deacetylase 5 mediates vascular endothelial growth factor induced gene expression and angiogenesis ［J］.J Biol Chem, 2008,283(21): 14590-14599.

［10］Liu G, Han J, Profirovic J, et al.Galpha13 regulates MEF2-dependent gene transcription in endothelial cells: role in angiogenesis ［J］.Angiogenesis, 2009, 12(1): 1-15.

［11］Wang W, Ha CH, Jhun BS, et al.Fluid shear stress stimulates phosphorylation dependent nuclear export of HDAC5 and mediates expression of KLF2 and eNOS ［J］.Blood, 2010,115(14): 2971-2979.