陳中皓 王學(xué)志 徐銘 楊華 黃忠華

上海市長寧區(qū)中心醫(yī)院胃腸外科，*病理科，▲化驗(yàn)科，上海 200336

結(jié)直腸癌是人類常見惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤死亡原因的第二位，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢［1］。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要，也是最本質(zhì)的生物學(xué)特征，臨床上主要采用以手術(shù)為主的綜合治療，但效果并不理想，其主要原因是腫瘤局部的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。近年來的研究表明，多種生物學(xué)指標(biāo)與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展以及手術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。我們采用免疫組化方法檢測Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，并探討其與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2002年6月—2004年1月我院手術(shù)切除的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者標(biāo)本72例，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及其他針對腫瘤的特殊治療。有結(jié)直腸癌家族史者不納入本研究。其中，男性45例，女性27例；年齡33～85歲，中位年齡54歲。根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟第七版惡性腫瘤TNM分期進(jìn)行臨床分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期19例，Ⅲ期30例，Ⅳ期11例。病理分級：高、中、低分化分別為18例、30例、24例。取所有腫瘤切除標(biāo)本切端非癌組織(距癌＞5 cm)作為正常對照。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病例經(jīng)病理、CT、B超、X光檢查4項(xiàng)中至少1項(xiàng)證實(shí)。

1.2 隨訪

術(shù)后第1年每3個(gè)月隨訪1次，以后每6個(gè)月隨訪1次，隨訪截止時(shí)間為2009年2月， 中位隨訪時(shí)間52個(gè)月(8～78個(gè)月)。本組共5例失訪，隨訪率為93.1%。

1.3 免疫組化方法

鼠抗人Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1單克隆抗體和SP試劑盒由美國Santa Cruz公司生產(chǎn)，將入選病例的原發(fā)灶病理蠟塊進(jìn)行常規(guī)切片，制成4 μm厚的切片，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)，SP免疫組化染色。染色步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷

細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽性細(xì)胞，判斷采用半定量積分法［2-3］，記數(shù)5個(gè)高倍視野，將平均陽性細(xì)胞率分為5類：0分＜5%；1分5%～＜25%；2分25%～＜50%；3分50%～＜75%；4分≥75%。根據(jù)陽性染色強(qiáng)度分為4類：無著色0分；淡黃色1分；黃色2分；棕黃色3分；兩者積分相加，按積分高低分為：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6～7分為強(qiáng)陽性(+++)。包括弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性均定義為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況

全組總的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為27.8%(20/72)，局部復(fù)發(fā)率為8.3%(6/72)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為19.4%(14/72)。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的中位時(shí)間為12個(gè)月(6～46個(gè)月)，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移在2年內(nèi)出現(xiàn)者占70.0%(14/20)，在3年內(nèi)出現(xiàn)者占85.0%(17/20)。

2.2 Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)

該5個(gè)分子陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖1)。在結(jié)直腸癌中表達(dá)的陽性率分別為62.5%(45/72)、66.7%(48/72)、55.5%(40/72)、61.1%(44/72)、79.2%(57/72)。結(jié)直腸癌組織與對照非癌組織中表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

Survivin表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)；MMP-2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)；nm23-H1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)；VEGF表達(dá)與浸潤深度、TNM分期、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)；而受體Flt-1表達(dá)與臨床病理及預(yù)后因素均無關(guān)。

3 討 論

Survivin屬凋亡家族(IAP)的成員，又稱生存素，全長15 kb，位于染色體17q75。通常Survivin僅在胚胎和胸腺中有微弱表達(dá)，但Survivin在幾乎所有的人類癌組織中都有表達(dá)［4］。Survivin可能主要通過2條途徑來抑制細(xì)胞凋亡：⑴直接抑制凋亡終末效應(yīng)酶Caspase-3和Caspase-7的活性來阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程; ⑵Survivin與周期蛋白激酶CDK4、CDK2相互作用阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5］。Kawasaki等［2］報(bào)道，Survivin在結(jié)直腸癌的表達(dá)陽性率為53.2%，而癌旁正常組織則無Survivin表達(dá)。本組研究顯示，Survivin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)陽性率為63.0%，與對照非癌組織中表達(dá)陽性率(12.5%)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且Survivin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤浸潤深度(P＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.01)及TNM分期(P＜0.05)相關(guān)，說明Survivin在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要作用。另外，本組研究顯示，Survivin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(P＜0.05)呈正相關(guān)，提示Survivin陽性表達(dá)可能提示預(yù)后不良。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要家族之一。它們在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色，MMPs通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中的大分子物質(zhì)(如膠原、層黏連蛋白等)而破壞癌細(xì)胞浸潤的物理屏障。MMP-2是MMPs家族中分布最廣的成員，因其主要反應(yīng)底物為細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原故又稱之為Ⅳ型膠原酶［6］。當(dāng)細(xì)胞惡變時(shí)常有MMP-2的升高，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)MMP-2表達(dá)的增高，在部分腫瘤中還發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤惡性程度的增高，MMP-2的表達(dá)也增高，且與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)［7-8］。本研究中，MMP-2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與年齡、性別、分化程度和浸潤深度均無相關(guān)性，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.01)?？梢姡琈MP-2在結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用，并且是惡性侵襲性腫瘤的一個(gè)敏感指標(biāo)。

nm23-H1基因是1988年Steeg等［9］從鼠K-1735黑色素瘤的具有不同轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞系中分離出來的。nm23-H1基因定位于17q21.3，該基因全長約10 kb， 編碼一種相對分子質(zhì)量約為17×103的蛋白質(zhì)，具有二磷酸核苷激酶(NDPK)活性，NDPK的生物學(xué)功能是參與體內(nèi)三磷酸核生成，通過影響微管聚合狀態(tài)及G蛋白介導(dǎo)信號傳導(dǎo)通路，而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，從而對腫瘤增殖、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移起重要作用［9-12］。Leone等［13］首先報(bào)道約22%結(jié)腸癌中有nm23等位基因缺失。Berney等［14］研究認(rèn)為nm23-H1既具有結(jié)直腸腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能，并與腫瘤浸潤發(fā)展呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果與之基本一致，nm23-H1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期呈負(fù)相關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤分化、浸潤深度等無關(guān)。由此可見，nm23-H1基因突變或表達(dá)異常是結(jié)直腸癌發(fā)展中的重要事件，可作為提示腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的1項(xiàng)指標(biāo)。

VEGF是最重要的血管生成因子之一，又稱血管通透因子。VEGF基因位于6p21.3，全長14 kb，由8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子組成［15］。VEGF具有促血管形成，增加血管通透性的雙重功能，在創(chuàng)傷愈合、胚胎期血管形成及腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移等方面均起著重要作用，對腫瘤血管基質(zhì)形成及腫瘤生物學(xué)行為均有重要影響，可作為腫瘤代謝及轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示：VEGF表達(dá)在結(jié)直腸癌組織明顯高于對照正常組織，并且與腫瘤浸潤深度、TNM分期、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示VEGF在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并可作為結(jié)直腸癌預(yù)后判斷的指標(biāo)。

Flt-1是血管內(nèi)皮生長因子受體家族中的成員之一，他主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，通常情況下Flt-1呈低表達(dá)，僅用于維持正常的微血管密度、基本滲透功能，以利于營養(yǎng)物質(zhì)代謝。Flt-1激活后具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞之間以及內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜之間的相互作用，能促進(jìn)血管腔的形成。本研究顯示Flt-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)率明顯高于對照組，卻與年齡、性別、分化程度、浸潤深度、TNM分期及預(yù)后均無相關(guān)性。

總之，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是個(gè)復(fù)雜的多基因參與的多步驟過程，Survivin、MMP-2、nm23-H1、VEGF及其受體Flt-1在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起著重要的作用，可能與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化及進(jìn)展轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。聯(lián)合檢測多個(gè)相關(guān)分子在結(jié)直腸癌中的表達(dá)將有助于判斷腫瘤的生物學(xué)特征和預(yù)后，并為進(jìn)一步基因診斷及分子靶向治療提供分子依據(jù)。

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