張薇 汪鍵 程越清 劉巖 李永紅

1.襄陽(yáng)市鐵路中心醫(yī)院病理科，湖北 襄陽(yáng) 441003；

2.湖北省中山醫(yī)院細(xì)胞病理室，湖北 武漢 430033

胸腹水細(xì)胞學(xué)檢查在鑒別癌性、炎性胸腹水上起著關(guān)鍵性作用。胸腹水細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有惡性腫瘤細(xì)胞，即胸腹水是由惡性腫瘤引起的。相反，胸腹水細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞，多數(shù)是由良性病變引起的。然而由于非典型增生的胸腹膜間皮細(xì)胞往往較難區(qū)別于惡性腫瘤細(xì)胞，可導(dǎo)致誤診。結(jié)合多項(xiàng)研究結(jié)果基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)：常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷癌性漿膜積水敏感度為58%，特異度為97%［1］。近十年來(lái)，有很多新方法用于鑒別癌性與炎性胸腹水［2-6］。當(dāng)DNA雙鏈中的倍體發(fā)生改變時(shí)，往往表示為惡性腫瘤細(xì)胞［7］。臨床上可用流式細(xì)胞儀和細(xì)胞圖像分析儀來(lái)測(cè)定細(xì)胞核內(nèi)DNA改變。流式細(xì)胞儀可在較短時(shí)間內(nèi)測(cè)定較多胸腹水細(xì)胞內(nèi)DNA含量，但它不能對(duì)少量細(xì)胞的樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察分析；而細(xì)胞圖像儀可對(duì)少量細(xì)胞樣品進(jìn)行DNA測(cè)定，也可進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察分析，但測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)。從研究結(jié)果看，細(xì)胞圖像分析儀較流式細(xì)胞儀敏感［8-9］。目前國(guó)內(nèi)臨床上所用的細(xì)胞圖像儀多為手動(dòng)的，需要用手來(lái)尋找可疑細(xì)胞，并對(duì)每一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行聚焦、測(cè)定，故需大量時(shí)間才能對(duì)少數(shù)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。全自動(dòng)細(xì)胞圖像分析儀可克服以上缺點(diǎn)，對(duì)較多的細(xì)胞樣品進(jìn)行全自動(dòng)測(cè)定，從而避免了人為因素影響。本研究試用DNA全自動(dòng)圖像分析儀研究惡性胸腹積水細(xì)胞中的非整倍體細(xì)胞。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

463例胸腹積水標(biāo)本在2005年1月—2010年5月來(lái)源本院和多個(gè)外院(大多為可疑胸腹積水)送往本院檢測(cè)的。

1.2 標(biāo)本處理

每例50～100 mL胸腹水細(xì)胞離心后(1 000×g，10 min)，經(jīng)Sed-Fix固定液(美國(guó)Surgioath Medical Inc)固定20 min，再次離心，清洗后用涂片離心機(jī)(武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司制成4張薄層細(xì)胞片。2張細(xì)胞片用Papanicotaou染色，常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查是由2位有30年經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞病理學(xué)專家做出。

1.3 結(jié)果判定

常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為3類：⑴炎性胸腹水(包括急性炎癥、結(jié)核和慢性炎癥)，⑵惡性腫瘤可疑胸腹水，⑶癌性胸腹水包(括惡性間皮瘤和轉(zhuǎn)移性癌等)。全自動(dòng)DNA細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(DNA Image Cytometer，DNA-ICM，武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司)測(cè)定方法，對(duì)每例4 000個(gè)以上的胸腹水細(xì)胞核進(jìn)行自動(dòng)聚焦測(cè)定每個(gè)細(xì)胞核的78個(gè)核特征，自動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)，自動(dòng)打印DNA倍體分析直方圖和細(xì)胞點(diǎn)陣分布圖。二倍體細(xì)胞(G1/G0)的DNA含量為2c(c為DNA含量單位, DNA content)；四倍體細(xì)胞(G2/M期)的DNA含量為4c。2c細(xì)胞和4c細(xì)胞為整倍體細(xì)胞。DNA定量診斷癌性胸腹水的陽(yáng)性指征分為3類：⑴3個(gè)或3個(gè)以上的大于5c非整倍體細(xì)胞，⑵在2.2c至3.6c之間或大于5c 位置形成一個(gè)非整倍體峰值或多個(gè)非整倍體峰值，⑶4c的細(xì)胞數(shù)占被測(cè)細(xì)胞總數(shù)10%以上時(shí)。

2 結(jié) 果

463例胸腹積水中，常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷炎性積水193例，轉(zhuǎn)移性腺癌177例，淋巴瘤16例，間皮瘤30例，疑為增生或核異質(zhì)47例。經(jīng)臨床和病理診斷證實(shí)，除疑為增生或核異質(zhì)47例外，常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷正確。

2.1 診斷明確的416例胸腹積水病例DNAICM診斷結(jié)果

由表1可見(jiàn)，在193例炎性積水中DNA-ICM檢測(cè)未見(jiàn)非整倍體細(xì)胞。177例轉(zhuǎn)移性腺癌中只有2例未見(jiàn)非整倍體細(xì)胞，4例有1～2個(gè)非整倍體細(xì)胞，61例有3個(gè)或3個(gè)以上非整倍體細(xì)胞，110例為非整倍體細(xì)胞峰。16例淋巴瘤中有3例未見(jiàn)大于5c的非整倍體細(xì)胞，1例有2個(gè)非整倍體細(xì)胞，7例有3個(gè)或3個(gè)以上的非整倍體細(xì)胞，5例可見(jiàn)非整倍體細(xì)胞峰。30例間皮細(xì)胞瘤中，2例未見(jiàn)大于5c的非整倍體細(xì)胞，9例可見(jiàn)3個(gè)或3個(gè)以上的非整倍體細(xì)胞，19例可見(jiàn)非整倍體細(xì)胞峰。

2.2 非整倍體細(xì)胞峰(stemline aneuploidy)形式及分布

癌性胸腹水患者大多處于腫瘤晚期階段。在大多癌性胸腹水病例中，都可見(jiàn)非整倍體細(xì)胞峰。由表1可見(jiàn)，62%轉(zhuǎn)移性腺癌，38%的淋巴瘤和63%的間皮細(xì)胞瘤均可見(jiàn)非整倍體細(xì)胞峰。從峰的多少和形式來(lái)看，以上3種癌性胸腹水非整倍體細(xì)胞峰形見(jiàn)表2。非整倍體細(xì)胞峰可表現(xiàn)為單峰、雙峰、多峰或片狀峰3種形式。轉(zhuǎn)移性腺癌和間皮細(xì)胞瘤大多數(shù)都以單峰和雙峰形式存在。非整倍體細(xì)胞峰出現(xiàn)位置也不相同，但大多數(shù)出現(xiàn)S期，即2.2c至3.6c之間。由表3可見(jiàn)，83%轉(zhuǎn)移性腺癌和68%間皮細(xì)胞瘤非整倍體細(xì)胞峰分布在2.6c至3.4c之間。淋巴瘤胸腹水病例細(xì)胞在S期分布較有特點(diǎn)，即使無(wú)大于5c的非整倍體細(xì)胞，S期細(xì)胞分布成片。這種圖形明顯不同于轉(zhuǎn)移性腺癌和間皮細(xì)胞瘤(圖1、2)。

表 1 胸腹積水常規(guī)細(xì)胞學(xué)和DNA-IMC診斷結(jié)果Tab.1 Results of 416 serous effusions diagnosed by conventional cytology and DNA-ICM

2.3 ＞5c的非整倍體細(xì)胞數(shù)

比較多種胸腹積水中＞5c細(xì)胞的百分率(表4)，炎性積水沒(méi)有＞5c細(xì)胞，轉(zhuǎn)移性腺癌中約有3.8% ＞5c細(xì)胞，淋巴瘤和間皮細(xì)胞瘤分別有6.6%和6.2%的細(xì)胞＞5c。

表 2 癌性胸腹積水非整倍體細(xì)胞峰的峰形情況Tab.2 Number of stemline aneuploidy in malignant serous effusions

2.4 47個(gè)可疑病例DNA-ICM的診斷結(jié)果

表5顯示通過(guò)隨訪患者或家屬而確診了27例，另20例由于無(wú)法與患者或家屬聯(lián)系而不能最終明確診斷。在確診的10例炎性積水中，DNA-ICM發(fā)現(xiàn)8例有1～2個(gè)＞5c的非整倍體細(xì)胞。另外17例確診的癌性積水中均可見(jiàn)有＞5c的非整倍體細(xì)胞，其中有非整倍體細(xì)胞峰11例。

表 4 不同胸腹水＞5c細(xì)胞的百分率Tab.4 Percentage of ＞5c aneuploid cells in different effusions

表 3 不同DNA含量非整倍體細(xì)胞峰的分布Tab.3 Distribution of different stemline aneuploidy in malignant effusions

表 5 47例異型增生病例的DNA-ICM診斷結(jié)果Tab.5 Diagnosis of 47 suspicious cases by DNA-ICM

3 討 論

我們的研究結(jié)果與其他作者的研究結(jié)果一致［4-6,8-9］，DNA-ICM檢測(cè)炎性胸腹積水時(shí)，大多未見(jiàn)非整倍體細(xì)胞，即使可見(jiàn)非整倍體細(xì)胞，也只是1～2個(gè)。而癌性胸腹積水絕大多可見(jiàn)非整倍體細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞峰。由此可見(jiàn)，癌性胸腹積水的癌細(xì)胞染色體倍數(shù)已發(fā)生了改變，用DNA-ICM可診斷和鑒別診斷炎性和癌性胸腹積水。

通過(guò)對(duì)DNA-ICM直方圖的分析，可鑒別不同性質(zhì)的癌性胸腹積水。淋巴癌性胸腹積水非整倍體細(xì)胞多出現(xiàn)在S期，呈片狀分布；而轉(zhuǎn)移性胸腹水非整倍體細(xì)胞以細(xì)胞單峰形式出現(xiàn)在S期，并可在4c和8c之間出現(xiàn)第2個(gè)峰。非整倍體細(xì)胞峰愈多、染色體愈不穩(wěn)定，腫瘤的惡性程度愈高，預(yù)后愈差。因此癌性胸腹水的DNA-ICM圖形也可用于腫瘤的惡性程度和預(yù)后的評(píng)估。

癌性胸腹積水中非整倍體細(xì)胞峰可有不同DNA含量，其原理不清楚。非整倍體細(xì)胞峰出現(xiàn)的位置主要決定于癌細(xì)胞內(nèi)染色體的倍數(shù)。如果癌細(xì)胞的染色體倍數(shù)為正常細(xì)胞的1.5倍，那么，就可能在3c處出現(xiàn)一個(gè)峰；如果癌細(xì)胞染色體倍數(shù)為正常細(xì)胞的3倍，非整倍體細(xì)胞的峰就可出現(xiàn)在6c的位置。胸腹積水非整倍體細(xì)胞峰出現(xiàn)的不同部位可能與原發(fā)腫瘤種類、性質(zhì)和發(fā)展程度有關(guān)。

DNA-ICM在診斷胸腹積水中尚存在問(wèn)題，如⑴少數(shù)非整倍體細(xì)胞：從本研究中可見(jiàn)，極少數(shù)炎性和少數(shù)癌性胸腹積水中均可出現(xiàn)1～2個(gè)非整倍體細(xì)胞。因此，對(duì)1～2個(gè)非整倍體細(xì)胞如何處理要非常慎重。少數(shù)炎性胸腹積水細(xì)胞可出現(xiàn)細(xì)胞退變或核固縮，這些細(xì)胞在Feulgen染色時(shí)，可出現(xiàn)＞5c細(xì)胞。但這些＞5c細(xì)胞的數(shù)量和例數(shù)非常小。當(dāng)出現(xiàn)1～2個(gè)大于5c細(xì)胞時(shí)，可反復(fù)檢查，做免疫組化等方法來(lái)鑒別炎性或癌胸腹積水。⑵DNA-ICM對(duì)成團(tuán)的癌細(xì)胞不能識(shí)別：由于本研究所用DNA-ICM的軟件尚不能將成團(tuán)的細(xì)胞分割開(kāi)來(lái)。因此，DNA-ICM將這類細(xì)胞作為“垃圾”處理。轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞常聚集成團(tuán)，DNA-ICM有時(shí)不能識(shí)別出來(lái)而誤診。

總之，DNA-ICM可用于診斷炎性或癌性胸腹積水，也可用它來(lái)判別癌性胸腹積水的性質(zhì)和惡性程度。

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