龔敏 梁鑫淼 崔曉楠

1.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116011；

2.中科院大連化學物理研究所制藥工程與過程化學研究中心，遼寧 大連 116023

目前治療原發(fā)性肝癌缺乏有效的治療藥物，療效差，易產生多藥耐藥，并且不良反應較大，因而探索高效低毒的抗肝癌藥物歷來是熱點問題［1］。欖香烯(elemene，ELE )是從活血化瘀中藥姜科植物溫莪術中提取出的抗癌活性單體，臨床應用表明，ELE對多種腫瘤具有抑制作用，表現(xiàn)出高效低毒的中藥特質，尤其對肝癌顯示出良好臨床療效［2］。然而其機制有待深入研究。DNA 拓撲異構酶Ⅰ(topoisomerase Ⅰ，TOPOⅠ)是調節(jié)核酸拓撲構型的關鍵酶，已成為抗癌藥物研究的重要靶點之一［3］。本文探討ELE對人肝癌HepG-2細胞增殖及TOPOⅠ表達及活性的影響，為解析ELE作用機制及探索有效的肝癌藥物奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細胞株HepG-2由大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院中心實驗室傳代、保存；ELE購自大連金港制藥有限公司(批號0508031)；羥基喜樹堿(hydroxycam ptothecin，HCPT)購自深圳萬東藥業(yè)有限公司；MTT購自Biosharp公司；PBR322DNA、TOPOⅠ和RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；PCR擴增引物由大連寶生物工程有限公司合成；碘化丙啶購自Sigma公司；溴化乙錠購自Amresco公司；TRIzol試劑盒購自Invitrogen公司；氯仿、異丙醇和乙醇均為國產分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)

將HepG-2細胞接種于含10%新生牛血清的低糖IMDM培養(yǎng)基中。于CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃且飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。每2 d更換1次培養(yǎng)基，細胞長至鋪滿瓶底約90%時用0.25%胰蛋白酶消化后傳代。

1.3 MTT法檢測腫瘤細胞的增殖

用0.25%胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的HepG-2細胞，用單純培養(yǎng)液配成單個懸浮細胞(濃度為5×104/mL)，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為100 μL，每組設8個復孔，另設空白組(只加培養(yǎng)液不加細胞，其他實驗步驟保持一致，最后比色時，以空白組孔調零)。在溫箱溫育24 h后去原培養(yǎng)液，實驗組分別加入ELE至200 μL/孔，使其濃度分別為20、40、60、80、100、120、140、160、180及200 μg/mL，另設對照組(培養(yǎng)液ELE為0)。將細胞置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48及72 h。在各個時間點的前4 h每孔加入MTT液20 μL(5 mg/mL)，避光繼續(xù)溫育，4 h后用1 mL注射器小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，震蕩6 min使結晶完全溶解，于酶標儀570 nm波長下，以空白孔調零，測定各孔吸光值(D)。按公式計算不同濃度藥物對腫瘤細胞生長的抑制率(IR)及半數(shù)抑制濃度(IC50)，繪制劑量效應曲線及時效曲線。IR(%)=(D對照組-D試驗組)/(D對照組-D空白組)×100%；以藥物濃度為橫軸，細胞抑制率為縱軸，根據(jù)量效曲線計算半數(shù)抑制濃度(IC50值)。 實驗重復3次。

1.4 流式細胞術分析細胞周期

調細胞濃度至1×106/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，將HepG-2細胞分為4組，分別為對照組(未加藥物)和3個實驗組(ELE濃度為20、40和60 μg/mL)。細胞處理后置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，0.25%的胰蛋白酶消化，離心(560×g)5 min，棄上清液，冷PBS洗2次，重懸于70%冷乙醇中，充分混勻，4 ℃固定過夜。加入25 μL RNaseA，置于37 ℃30 min，再加入25 μL PI染料，4 ℃避光靜置30 min，在流式細胞儀(FACS Vantage SE)上進行周期分析。實驗重復3次。

1.5 RT-PCR 檢測TOPOⅠmRNA含量

取對數(shù)生長期細胞調濃度至5×105/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內，設立對照組(未加藥物)和實驗組(ELE濃度為20、40和60 μg/mL)，培養(yǎng)48 h后收集各組細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA(按TRIzol 抽提試劑說明書進行)。RT-PCR步驟按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0說明書進行，將RNA反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR反應，β-actin為內參照。TOPOⅠ引物序列為：上游引物：5’-CGCTATCCTGAAGGCATCAA-3’；下游引物：5’-CTGGAGGAGGAGAAGGAACC-3’。擴增產物為565 bp。β-actin引物序列：上游引物5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’；下游引物：5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’，擴增產物為404 bp。TOPOⅠ按以下條件進行PCR反應：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。β-actin按以下條件進行PCR反應：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行30個循環(huán)；最后72 ℃終延伸5 min。將擴增的RTPCR產物在1×TAE緩沖液中1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，電壓控制在 90 V，UVP凝膠成像及分析系統(tǒng)觀察、拍照、分析。實驗重復3次。

1.6 TOPOⅠ介導的解旋作用

反應體系的組成：PBR322DNA 0.5 μg，TOPOⅠ Buffer 2 μL，TOPOⅠ 1 U(1 U定義為在標準的反應條件下使0.01 μg/μL負超螺旋PBR322完全解旋的酶量)，0.1% BSA 2 μL，不同濃度的ELE 4 μL為實驗組，不同濃度的HCPT 4 μL為陽性對照組，雙蒸水補足至20 μL。37 ℃溫育30 min后，加入1 μL的終止液(1% SDS，50%甘油，0.05%溴酚藍)，在1×TAE緩沖液中1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，電壓控制在136 V。電泳結束后，0.5 μg/mL溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色30 min，UVP凝膠成像及分析系統(tǒng)觀察、拍照、分析。實驗重復3次。

1.7 ELE對DNA的直接作用

反應體系的組成：PBR322DNA 0.5 μg，TOPOⅠ Buffer 2 μL，不同濃度的ELE 4 μL為實驗組，以PBR322DNA為陰性對照組，雙蒸水補足至20 μL。37 ℃溫育30 min，加入1 μL的終止液(1% SDS，50%甘油，0.05%溴酚藍)，電泳，染色及拍照同上，實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，對符合正態(tài)分布資料的均數(shù)用表示。對多組均數(shù)比較采用單因素多水平設計定量資料的方差分析，并通Dunnett檢驗進行實驗組與對照組的兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。［(21.47±0.59)%］(P＜0.05)，呈現(xiàn)劑量依賴性(圖2)。

2 結 果

2.1 MTT法檢測腫瘤細胞生長狀態(tài)

隨著藥物濃度及作用時間增加，細胞增殖能力逐漸下降，表現(xiàn)為時間和劑量依賴性；藥物作用24、48和72 h 后，IC50值分別為96.13、80.84和60.95 μg/mL(圖1)。

2.2 ELE對HepG-2細胞周期的影響

藥物作用48 h后，實驗組(ELE濃度分別為20、40和60 μg/mL)的S期細胞比例［(42.36±3.40)%、(47.86±4.83)%和(6 0.9 5±4.6 1)%］顯著高于對照組

2.3 ELE對HepG-2細胞TOPOⅠmRNA 表達的影響

藥物作用48 h后，實驗組(ELE濃度分別為20、40和60 μg/mL)TOPOⅠmRNA與β-actin mRNA條帶灰度比值(0.84±0.08、0.68±0.01和0.58±0.04)顯著低于對照組(1.10±0.06)(P＜0.05)，提示ELE可抑制TOPOⅠ轉錄，并呈劑量依賴性(圖3)。

2.4 ELE對TOPOⅠ介導的負超螺旋PBR322DNA解旋作用的影響

TOPOⅠ切斷DNA雙鏈中的一股，使DNA雙鏈在解鏈旋轉中不致打結，適當時候又把切口封閉，使DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)，從而可催化超螺旋的DNA松弛解旋。采用TOPOⅠ介導的負超螺旋PBR322DNA解旋作用，觀察ELE對TOPOⅠ活性的影響。如圖4所示，泳道1是負超螺旋PBR322DNA(supercoiled DNA，S)；泳道2是加酶反應后，超螺旋解旋成為松散型DNA(Relaxed DNA，R)；泳道3、4是為陽性對照組，在HCPT(典型的TOPO I 抑制劑)濃度為5 μg/mL時對TOPOⅠ介導的解旋反應無抑制作用，在濃度為1 μg/μL時完全抑制了TOPOⅠ對PBR322 DNA的解旋作用；泳道5是HCPT 1 μg/μL聯(lián)合ELE 40 μg/mL對TOPOⅠ介導的負超螺旋PBR322DNA解旋作用的影響，如圖可見抑制了TOPOⅠ的活性。泳道6～11是不同濃度的ELE對TOPOⅠ介導的負超螺旋PBR322DNA解旋作用的影響。結果表明，ELE 40、60、80和100 μg/mL組對TOPOⅠ的活性有抑制作用，掃描其光密度最大值分別為(58±3、80±6、92±10和134±12)，經統(tǒng)計分析顯示，ELE 100 μg/mL組與40、60和80 μg/mL組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，ELE對TOPOⅠ的活性有抑制作用，其抑制作用具有劑量依賴性(圖4)。

圖 3 ELE作用于人肝癌HepG-2細胞48 h后TOPOⅠmRNA表達的變化Fig.3 TOPOⅠ mRNA expression of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells interfered by ELE for 48 h

圖 4 ELE抑制TOPOⅠ介導的負超螺旋PBR322DNA的解旋作用Fig.4 Inhibition of ELE on TOPOⅠ-mediatedunwinding effect of negative supercoil PBR322DNA

2.5 ELE對負超螺旋PBR322DNA無直接抑制作用

采用負超螺旋PBR322DNA觀察ELE對DNA的直接作用。結果表明，對照組及各藥物組平均光密度值分別為(22 860±2 412、24 572±518、22 318±651、22 781±837、20 781±1 180和24 284±749)，各組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，提示ELE不能直接引起負超螺旋PBR322DNA的雙鏈斷裂，對DNA不能產生直接的作用(圖5)。

圖 5 ELE對負超螺旋PBR322DNA的直接作用Fig.5 Direct effect of ELE on negative supercoil PBR322DNA

3 討 論

原發(fā)性肝癌是人類惡性腫瘤死亡因素的重要構成，發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康。目前缺乏有效的治療措施，作為化療非敏感腫瘤，肝癌目前化療藥物有效率＜20%［4］。索拉非尼、厄洛替尼等靶向藥物在肝癌中的療效尚處臨床觀察階段［5］，雖然索拉非尼是第一個被臨床證實能夠輕度延長肝癌患者生存期的藥物，然而有效率低，不良反應有別于化學藥物，臨床尚處于認識階段，因出現(xiàn)藥物所致死亡病例，限制了索拉非尼的臨床應用，探索高效低毒的抗肝癌藥物是基礎醫(yī)學與臨床醫(yī)學關注的熱點。

從天然藥物中篩選高效低毒的抗腫瘤藥物是獲取抗腫瘤藥物的基本策略。ELE是從我國傳統(tǒng)中藥溫莪術中提取的抗癌單體，臨床抗腫瘤療效評價良好，尤其對化療非敏感腫瘤肝癌表現(xiàn)出抑癌效果［6］。臨床報道表明，應用ELE肝動脈栓塞治療中晚期肝癌療效理想，可顯著抑制腫瘤生長，提高患者生存質量，并顯示出生存優(yōu)勢，與化療聯(lián)合應用表現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤作用，并降低了化療不良反應［7］。基礎研究表明ELE能夠促進腫瘤細胞凋亡，誘導細胞周期阻滯，干擾信號轉導通路，抑制腫瘤轉移等抗腫瘤作用［8］。然而有關ELE對TOPO的作用未見報道。

TOPO是調節(jié)核酸拓撲構型的關鍵酶，其催化單鏈或雙鏈DNA短暫分離以利于復制。按其誘導DNA斷裂機制的不同分為TOPOⅠ和TOPOⅡ(TOPOⅡα、TOPOⅡβ)兩類［9］。TOPOⅠ是生物體內廣泛存在的一類必需酶，參與DNA復制、轉錄、重組和修復等所有關鍵的核過程［10］。該類酶通過調節(jié)超螺旋、連鎖/去連鎖以及核酸解結作用，影響DNA拓撲結構［11］。TOPOⅠ是S期關鍵酶，對腫瘤細胞的增殖起到至關重要作用，是目前一線抗腫瘤藥物如HCPT、拓撲替康及伊立替康的藥效靶點，干擾TOPOⅠ表達是目前抗癌藥物的重要作用機制［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，ELE能夠抑制人肝癌HepG-2細胞增殖，呈時間與劑量依賴性特征，并可將HepG-2細胞阻滯于S期。DNA復制是S期的主要事件，作為調節(jié)核酸拓撲構型的關鍵酶，TOPOⅠ在S期DNA復制過程起重要作用，因而，干擾TOPOⅠ可能影響S期細胞生命活動，導致腫瘤細胞S期阻滯，從而啟動腫瘤細胞的凋亡過程。研究表明ELE能夠影響肝癌細胞凋亡相關基因、熱休克蛋白及其相關調控因子基因的表達，抑制肝癌細胞遷移、侵襲等［13-14］，表現(xiàn)為多靶位的抗肝癌作用。我們的研究首次表明干擾TOPOⅠ表達及活性可能為ELE抑制肝癌的作用靶位，ELE是值得關注的抗肝癌藥物。

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