尤燕舞，黃海玲，林 栩

(1右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色533000;2右江民族醫(yī)學(xué)院組胚教研室)

腎素—血管緊張素(RAS)系統(tǒng)對水、電解質(zhì)平衡及血壓調(diào)節(jié)起重要作用，不同個體RAS的活性不同，也同時受系統(tǒng)組成成分的表達(dá)以及活性的影響。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)具有直接的縮血管作用，是RAS中最重要的活性介質(zhì)之一。研究證實，AngⅡ在人體中主要通過血管緊張Ⅱ1型受體(AT1R)發(fā)揮作用，決定AT1R蛋白表達(dá)的基因是否存在某種或某些變異，影響著AT1R的結(jié)構(gòu)及功能，從而影響RAS的活性效應(yīng)。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(ACE)催化AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ，是RAS系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，可同時滅活有舒血管作用的緩激肽，與血管內(nèi)皮增生及多種細(xì)胞因子的作用密切相關(guān)。RAS中另一候選基因為血管緊張素原(AGT)基因，其第2外顯子704 T/C變異導(dǎo)致編碼產(chǎn)物第235號甲硫氨酸變?yōu)樘K氨酸(M235T)，AGT M235T多態(tài)與血漿AGT水平有關(guān)。2011年4～6月，本文對 AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多態(tài)性進(jìn)行了研究，以確定其在桂西地區(qū)正常壯族人群中的分布。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 桂西地區(qū)壯族人150例，男78例、女72 例，年齡(42.6 ±11.2)歲，血常規(guī)、血脂及其他生化指標(biāo)均在參考范圍內(nèi)，心電圖檢查正常，排除肝臟、腎臟、內(nèi)分泌和心腦血管疾病。研究對象均來自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，為正常健康體檢者，且相互間無血緣關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集體檢健康者靜脈血3 ml，用 EDTA－K2抗凝，采用改良碘化鈉法提取白細(xì)胞基因組DNA，－86℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AT1R基因 A1166C多態(tài)性檢測 采用PCR－RFLP 法。正引物為:5'－CACCATGTTTTGAGGTT－3'，負(fù)引物為:5'－CGAGTTTCTGACATTGTTC－3'。建立50 μl的反應(yīng)體系后，放入PCR擴(kuò)增儀:變性94℃ 300 s，退火50℃ 120 s，延伸72℃ 120 s，30個循環(huán)后，在72℃充分延伸10min，PCR產(chǎn)物在37℃用DdeⅠ水解過夜。電泳可見277 bp的等位基因11662A片段(切點(diǎn)消失)，等位基因11662C(切點(diǎn)存在)呈167 bp及110 bp兩個片段。

1.2.3 ACE基因I/D多態(tài)性檢測 采用直接PCR法。正引物為 5'－CTGGAGACCACTCCCATCCTTTC－3'，負(fù) 引 物 為 5'－GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT－3'。PCR 體系為50 μl。變性、退火和延伸條件分別為94℃ 1min，58℃ 2min，72℃ 2min，共30個循環(huán)。電泳可見D等位基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為190 bp，I等位基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為490 bp。

1.2.4 AGT基因 M235T多態(tài)性檢測 采用 PCR－RFLP 法。 正 引 物 5'－CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT－3';負(fù)引物 5'－CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC－3'。PCR 體系為 50 μl。在 94 ℃ 變性 3min。冰浴后加入Taq酶2 U混勻，再加石蠟油30 μl，進(jìn)行94℃ 15 s變性，65℃ 50 s退火，72℃ 45 s延伸，循環(huán)35次。Takara內(nèi)切酶TthⅢ 1酶切，65℃水浴3 h。電泳可見基因型有3種:純合子MM只見1條163 bp電泳帶，純合子TT可見140 bp電泳帶，雜合子TM可見163 bp、140 bp兩條電泳帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗和方差分析，用Hardy－Weinbery遺傳平衡定律確認(rèn)各基因頻率是否達(dá)到遺傳平衡。以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 AT1R基因A1166C多態(tài)性在不同種族人群間的比較 見表1。

2.2 ACE基因I/D多態(tài)性在不同種族人群間的比較 見表2。

2.3 AGT基因M235T多態(tài)性在不同種族人群間的比較 見表3。

表1 不同種族AT1R基因A1166C多態(tài)性分布頻率的比較［例(%)］

表2 不同種族ACE基因I/D多態(tài)性分布頻率的比較［例(%)］

表3 不同種族AGT基因M235T多態(tài)性分布頻率的比較［例(%)］

3 討論

腎素是一種酸性蛋白質(zhì)，由腎臟近球細(xì)胞合成和分泌后，經(jīng)腎靜脈進(jìn)入血循環(huán)。血漿中的AGT為腎素底物，在腎素的作用下水解，產(chǎn)生一個十肽即血管緊張素Ⅰ。血管緊張素Ⅰ的血管活性非常低，但在經(jīng)過肺循環(huán)時，可在肺血管內(nèi)皮表面的ACE作用下水解，產(chǎn)生一個八肽即血管緊張素Ⅱ。血管緊張素Ⅱ在血漿、組織中的血管緊張素A作用下，失去一個氨基酸，成為七肽的血管緊張素Ⅲ。血管緊張素Ⅱ和血管緊張素Ⅲ與血管平滑肌、腎上腺皮質(zhì)等組織細(xì)胞的血管緊張素受體結(jié)合，引起相應(yīng)的生理效應(yīng)。血管緊張素Ⅱ與其受體結(jié)合后，可作用于全身多個系統(tǒng)，對心肌肥厚、心力衰竭、高血壓、血管疾病、糖尿病、腎臟疾病等的發(fā)生、發(fā)展均有重要作用。RAS系統(tǒng)相關(guān)基因的多態(tài)性近年來成為研究熱點(diǎn)，研究較多的是AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多態(tài)性。桂西地區(qū)作為少數(shù)民族聚居地，以壯族人群居多，本文研究桂西地區(qū)壯族人群RAS系統(tǒng)AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多態(tài)性的分布頻率，并與不同種族人群進(jìn)行比較。

本文采用PCR－RFLP技術(shù)及 DNA測序法首次獲得了桂西地區(qū)壯族人群RAS系統(tǒng)AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多態(tài)性的分布情況。結(jié)果顯示，三者等位基因頻率在桂西地區(qū)壯族人群中分別為 92.0%、8.0%，53.3%、46.7%，13.3%、86.7%。與國外同類研究結(jié)果比較，桂西地區(qū)壯族人群AT1R基因A1166C基因型和等位基因頻率與土耳其人［1］比較有統(tǒng)計學(xué)差異，而與日本人［2］、中國其他地區(qū)人群［3，4］比較無統(tǒng)計學(xué)差異;桂西地區(qū)壯族人群ACE基因I/D基因型頻率與法國人［5］、土耳其人［1］比較有統(tǒng)計學(xué)差異，而等位基因頻率無統(tǒng)計學(xué)差異，基因型和等位基因頻率與黎巴嫩人［6］、巴林人［7］比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而與蒙古族人［8］、日本人［2］比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;桂西地區(qū)壯族人群AGT基因M235T基因型和等位基因頻率與法國人［5］、蒙古族人［8］、土耳其人［1］、波蘭人［9］比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而與日本人［2］比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果提示RAS系統(tǒng)基因多態(tài)性在不同種族間分布頻率存在差異，這種差異勢必會對RAS系統(tǒng)基因在一些疾病特別是地方高發(fā)性疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用造成一定的影響。

［1］?zkaya O，S?ylemezo?lu O，G?nen S，et al.Renin－angiotensin system gene polymorphisms:association with susceptibility to Henoch－Schonlein purpura and renal involvement［J］.Clin Rheumatol，2006，25(6):861－865.

［2］Hishimoto A，Shirakawa O，Nishiguchi N，et al.Association between a functional polymorphism in the renin－angiotensin system and completed suicide［J］.J Neural Transm，2006，113(12):1915－1920.

［3］郭明秋，李莉，苗翠，等.ACE基因和AT1R基因多態(tài)性與糖尿病相關(guān)性的研究［J］.華中醫(yī)學(xué)雜志，2007，31(1):25－27.

［4］李榮，張寧，康莉，等.腎素—血管緊張素系統(tǒng)基因多肽性與IgA腎病的關(guān)系［J］.臨床薈萃，2007，22(10):685－688.

［5］Mondry A，Loh M，Liu P，et al.Polymorphisms of the insertion/deletion ACE and M235T AGT genes and hypertension:surprising new findings and meta－analysis of data［J］.BMC Nephrol，2005，6(1):1－11.

［6］Sabbagh AS，Otrock ZK，Mahfoud ZR，et al.Angiotensin－converting enzyme gene polymorphism and allele frequencies in the lebanese population:prevalence and review of the literature［J］.Mol Biol Rep，2007，34(1):47－52.

［7］Al－Harbi EM，F(xiàn)arid EM，Gumaa KA，et al.Angiotensin－converting enzyme gene polymorphisms and T2DM in a case－control association study of the Bahraini population［J］.Mol Cell Biochem，2011，350(1－2):119－125.

［8］Wang GY，Wang YH，Xu Q，et al.Associations between RAS gene polymorphisms，environmental factors and hypertension in Mongolian people［J］.Eur J Epidemiol，2006，21(4):287－292.

［9］Niemiec P，Zak I，Wita K.The M235T polymorphism of the AGT gene modifies the risk of coronary artery disease associated with the presence of hypercholesterolemia［J］.Eur J Epidemiol，2008，23(5):256－262.