趙永順，吳春明，董 斌，位振清，徐英輝*

膠質(zhì)瘤作為最常見的惡性腦腫瘤，具有高度侵襲性，即使經(jīng)手術及放化療，平均生存期也很短［1］。欖香烯(Elemene)是從中藥莪術中提取的、由我國自主開發(fā)的國家二類抗腫瘤新藥，主要成分為β-欖香烯，屬于不含氧的倍半烯烴類。由于其低毒、高效和廣譜，被廣泛用于治療多種腫瘤［2-3］。體外研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯能有效抑制膠質(zhì)瘤細胞生長，具有明確的抗膠質(zhì)瘤作用［4］。欖香烯抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡是其抗膠質(zhì)瘤的重要機制，并且抑制增殖作用與p38MAPK信號通路的活化密切相關［5-7］，但其誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡的機制尚未闡明。本研究旨在通過觀察欖香烯對人源膠質(zhì)瘤U87細胞系Raf/MEK/ERK信號通路各蛋白活性及癌基因Bcl-2家族成員表達的影響，探討其誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡的相關機制，為欖香烯治療膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 2%欖香烯乳劑購自大連金港制藥公司;人源膠質(zhì)瘤U87細胞系購自中國科學院上海細胞生物學研究所;DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO BRL公司;Raf-1、ERK、磷酸化ERK蛋白質(zhì)單克隆抗體購自美國 Cell Signaling公司;磷酸化Raf-1(Tyr340/341)、Bcl-2、Bax、β-actin 蛋白質(zhì)單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人源膠質(zhì)瘤U87細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecoo's modified Eagle'smedium)培養(yǎng)基(青霉素50 IU/mL、鏈霉素 50 mg/mL)中，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)期U87膠質(zhì)瘤細胞，以5×104/mL密度接種25 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶5mL。24 h后，以欖香烯(40μg/mL)分別處理 U87 細胞0(對照組)、1、3、5、7、9 d，用含欖香烯(40μg/mL)的培養(yǎng)液每2 d換液。分別于處理后各個時間點收集各組細胞，PBS洗2次，1000 r/min離心5min，用4℃ PBS懸浮細胞并計數(shù)，制成約1×106/mL的單細胞懸液。在振蕩器上，緩慢加入2倍體積預冷－20℃的95%乙醇，充分搖勻，固定。4℃冰箱保存，2周內(nèi)檢測。檢測當天，固定細胞用PBS洗2次，1000 r/min離心5min，加入RNase A 100 U/mL，置37℃水浴搖床30min，用10μg/mL 含 Triton X-100 的 PI染液染色，4℃避光30min。尼龍網(wǎng)過濾，流式細胞儀檢測，根據(jù)DNA直方圖中出現(xiàn)的亞二倍體峰(Ap峰)，由CellQuest軟件分析結(jié)果并計算凋亡細胞百分率(Apoptosis rate，AR)。

1.2.3 Raf-1、ERK、Bcl-2、Bax 蛋白質(zhì)表達的Western blot檢測 ①取對數(shù)生長期的人源U87膠質(zhì)瘤細胞，以4×105/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，再分別與 0、20、40、60 及 80μg/mL濃度的欖香烯共同孵育2 h。②吸掉培養(yǎng)液，PBS沖洗2次(在冰上操作)，每孔加裂解緩沖液RIPA buffer［50mm Tris-HCl(pH 7.4)，1.0%NP-40，0.25%Na-deoxycholate，150mm NaCl，1mm EDTA，1mm aprotinin，1 mg/mL PMSF，leupeptin and pepstatin］100μL，刮除細胞后混勻 30min，離心，取上清，分光光度計檢測濃度，加入上樣緩沖液調(diào)至相同終濃度，94℃煮5min。③配制10%SDS聚丙烯酰胺凝膠，上樣，60 V電泳1 h，然后調(diào)至100 V繼續(xù)電泳，直至溴酚藍稍跑出，將蛋白從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜上。④加一抗，4℃過夜。加二抗，室溫1 h。⑤ECL(Amersham)檢測，圖像定量分析軟件(ImageQuant 5.2 software，Amersham)分析蛋白條帶。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 10.0軟件，細胞計數(shù)檢測值以表示，數(shù)據(jù)差異采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 欖香烯呈時間依賴性誘導U87細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，U87細胞未經(jīng)欖香烯處理時，自然凋亡率很低。經(jīng)40μg/mL欖香烯處理0(對照組)、1、3、5、7、9 d 后，呈時間依賴性誘發(fā)凋亡。DNA含量直方圖可見，G0/G1峰前出現(xiàn)明顯的亞二倍體峰(Ap峰)，與對照組細胞相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1、圖2。

圖1 欖香烯誘導U87膠質(zhì)瘤細胞凋亡的DNA含量直方圖

圖2 欖香烯對U87膠質(zhì)瘤細胞的凋亡誘導

2.2 欖香烯抑制U87膠質(zhì)瘤細胞Raf/MEK/ERK 信號通路 20、40、60、80μg/mL 欖香烯分別處理U87細胞2 h后，磷酸化的ERK和Raf-1蛋白表達呈現(xiàn)漸進性降低，均低于對照組，但非磷酸化的ERK和Raf-1蛋白無明顯改變，見圖3。

2.3 欖香烯使U87瘤細胞的Bax/Bcl-2比值增高20、40、60、80μg/mL 欖香烯分別處理 U87 細胞48 h后，Bcl-2表達呈現(xiàn)漸進性降低，均低于對照組，但Bax表達無明顯改變，見圖4。

圖3 欖香烯下調(diào)U87細胞磷酸化Raf-1和磷酸化ERK蛋白表達水平

圖4 欖香烯下調(diào)U87細胞Bcl-2蛋白表達水平，使Bax/Bcl-2比值增加

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于多種生物(包括酵母和哺乳動物細胞)，參與介導生長、發(fā)育、分裂、分化、死亡以及細胞間功能同步等多種細胞過程［8］。MAPK信號通路主要包括:Extracellular signal-regulated kinases(ERK1/2)、Jun N-terminal kinases(JNK)及 p38MAPK 通路［9］。其中 ERK1/2信號通路(即Raf/MEK/ERK信號通路)調(diào)控細胞生長和分化，是將胞外的生長和神經(jīng)營養(yǎng)信號傳到核內(nèi)的蛋白激酶級聯(lián)反應中的重要組分［10－11］。而ERK1/2蛋白的下游底物有很多，包括癌基因Bcl-2。

Lyustikman等［12］報道，多數(shù)人類膠質(zhì)瘤中存在Ras蛋白的活性增高，引起其下游Raf/MEK/ERK信號通路的激活。而該通路的持續(xù)激活可以導致癌基因(如Bcl-2)的表達上調(diào)，最終腫瘤細胞得以“永生”。本研究表明，對照組(欖香烯濃度為0)的p-Raf-1及p-ERK含量最高，說明對照組的Raf-1及ERK蛋白活性最高。推測對照組的Raf/MEK/ERK信號通路的活性最高，具有組成性激活的特征。

線粒體凋亡途徑是細胞的重要凋亡途徑，該凋亡途徑利用線粒體作為核心成分，激活細胞凋亡。Bcl-2家族成員是調(diào)控線粒體介導的凋亡過程中的關鍵調(diào)節(jié)因子。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白(包括 Bax、Bak等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1 等)［13］。細胞內(nèi) Bcl-2 家族成員中的Bax/Bcl-2的比值增加能誘導線粒體釋放細胞色素c(cyt-c)，線粒體內(nèi)的cyt-c釋放入細胞質(zhì)后，與凋亡蛋白激活因子-1(Apaf-1)和Caspase-9的前體組合，形成凋亡小體，導致Caspase-9自身剪切和活化，活化的Caspase-9再酶解Caspase-3前體，從而活化Caspase-3，活化的Caspase-3剪切inhibitor ofcaspase-3-activated Dnase(ICAD)，于 是Caspase-3-activated DNase(CAD)被激活，剪切DNA，最終誘導細胞凋亡［14］。本研究結(jié)果表明，欖香烯可以使U87細胞的Bax/BcL-2比值增加，啟動細胞線粒體凋亡，最終使U87細胞凋亡;從而從側(cè)面驗證了Lyustikman等的結(jié)論。因此，Raf/MEK/ERK通路的組成性激活對于U87細胞的生存至關重要。

綜上所述，本研究證實:①欖香烯呈時間依賴性誘導U87細胞凋亡。②欖香烯呈劑量依賴性地下調(diào)人源膠質(zhì)瘤U87細胞磷酸化的Raf-1和ERK蛋白的表達，提示欖香烯抑制U87細胞的Raf/MEK/ERK信號通路。③欖香烯下調(diào)U87細胞中Bcl-2家族成員中的Bcl-2表達，但對Bax的表達無影響;欖香烯使U87細胞Bax/Bcl-2比值增高。

由此推斷，欖香烯誘導U87細胞凋亡的機制:抑制U87細胞賴以生存的Raf/MEK/ERK通路，從而下調(diào)Raf/MEK/ERK通路下游信號癌基因Bcl-2表達，增加Bax/Bcl-2比值，啟動線粒體凋亡程序，最終誘導U87細胞凋亡。

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