周紅宇，陽(yáng)學(xué)風(fēng)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種肝組織學(xué)改變的臨床病理綜合征，與酒精性肝病相類似，但與飲酒無(wú)明確關(guān)系。根據(jù)其病理學(xué)改變及臨床表現(xiàn)，分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化、脂肪性肝硬化［1］。肝臟所含脂質(zhì)絕大部分為甘油三酯，各種致病因素均可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)異常堆積，從而導(dǎo)致FLD的發(fā)生。

瘦素是肥胖基因(Obese gene)編碼的蛋白產(chǎn)物，受體廣泛分布于脂肪、骨骼肌、肝臟、心、肺、胰、卵巢、睪丸等組織。瘦素通過(guò)與受體結(jié)合發(fā)揮作用［2］，調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪的穩(wěn)定，抑制食欲、增加能耗和減少體重可能是瘦素的主要作用。本文以人肝L-02脂肪變細(xì)胞模型，通過(guò)油紅“O”染色、RTPCR等方法，對(duì)瘦素作用后的脂肪變細(xì)胞進(jìn)行研究，了解瘦素與NAFLD的關(guān)系，并初步探討瘦素對(duì)其的治療作用。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 非酒精性脂肪變肝細(xì)胞模型的建立 人肝L-02細(xì)胞株培養(yǎng)接種于50mL培養(yǎng)瓶中，在含體積分?jǐn)?shù)10%的滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的 1640完全培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)，飽和濕度，貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%瓶底，消化液消化傳代。在更換新鮮培養(yǎng)液后加入胎牛血清，使其濃度為50%，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，形成非酒精性肝細(xì)胞脂肪變性模型。

1.2 造模是否成功的判斷 Lillie氏油紅-O染色:將細(xì)胞培養(yǎng)于有無(wú)菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，用PBS沖洗蓋玻片5min(×3次)，50%異丙醇固定1min，油紅“O”染色10min，蒸餾水沖洗1min(×3次)，蘇木素染色5min，分色和返藍(lán)后，HPIAS-1000型圖像分析系統(tǒng)收集圖像。

1.3 RT-PCR法檢測(cè)人肝L-02乙酰輔酶A羧化酶(ACC)mRNA的表達(dá) 以 lμg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)為模板，通過(guò)半定量RT-PCR，以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 人肝L-02細(xì)胞脂肪化 正常細(xì)胞(圖1)用50%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，用油紅“O”染色，顯微鏡下觀察，細(xì)胞漿內(nèi)有大量脂滴存在，符合脂肪化肝細(xì)胞特點(diǎn)(圖2)。

圖1 正常肝細(xì)胞(油紅‘O’×400)

圖2 模型組(油紅‘O’×400)

2.2 不同瘦素劑量干預(yù)后脂肪化人肝L-02細(xì)胞的變化 脂肪化人肝L-02細(xì)胞分別用10－7mol/L、10－6mol/L、10－5mol/L 瘦素 +1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，用油紅“O”染色，顯微鏡下觀察，脂肪化程度逐漸減輕，見(jiàn)圖3～圖5。

圖3 模型組+瘦素10－7mol/L組(油紅‘O’×400)

圖4 模型組+瘦素10－6mol/L組

2.3 瘦素對(duì)人肝L-02脂肪變細(xì)胞乙酰輔酶A羧化酶mRNA表達(dá)的影響 用RT-PCR檢測(cè)人肝L-02細(xì)胞乙酰輔酶A羧化酶mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)瘦素處理的人肝L-02細(xì)胞乙酰輔酶A羧化酶mRNA的表達(dá)與瘦素呈濃度依賴性遞減。模型組、10－7mol/L、10－5mol/L 及10－5mol/L 瘦素處理組目的基因及GAPDH基因灰度值比值分別為0.867、0.745、0.642、0.512，正常組及正常細(xì)胞加瘦素組分別為0.460及0.437，見(jiàn)圖6。瘦素處理組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖5 模型組+瘦素10－5mol/L組

圖6 不同濃度瘦素處理對(duì)人肝L-02脂肪變細(xì)胞ACCmRNA表達(dá)的影響(灰度值)

3 討論

近年來(lái)，隨著生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的變化，檢測(cè)手段的提高，非酒精性脂肪肝(NAFLD)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。自1994年起，一系列研究結(jié)果表明，NAFLD的發(fā)病無(wú)性別差異，在非肥胖和糖尿病人群中也有較高的發(fā)病率。特別是發(fā)現(xiàn)NAFLD可進(jìn)展至肝炎、肝纖維化和肝硬化之后［3-4］，逐漸為人們所重視。約75%的2型糖尿病患者可發(fā)生不同形式的NAFLD;70%的肥胖患者發(fā)生脂肪肝，其中18%出現(xiàn) NASH［5］。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，人們廣泛認(rèn)同Day等［6］提出的“二次打擊”理論。多因素聯(lián)合作用誘發(fā)胰島素抵抗(IR)，后者通過(guò)增加脂肪分解和FFAs轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟導(dǎo)致第一次打擊—脂肪肝形成，并造成肝臟對(duì)第二次打擊的敏感性增強(qiáng)。氧應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化等進(jìn)一步促進(jìn)IR，加重氧應(yīng)激和肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞變性和肝纖維化，即第二次打擊。本研究結(jié)合文獻(xiàn)方法［7］，用高脂培養(yǎng)基造模，形成典型的非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型，主要研究NAFLD形成的第一步肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積及瘦素干預(yù)后的變化。

肝臟是體內(nèi)參與脂質(zhì)代謝的重要場(chǎng)所。肝臟脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的變化是構(gòu)成各種形式脂肪肝的基礎(chǔ)，各種致病因素可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)TG異常堆積。肝細(xì)胞不能儲(chǔ)存脂肪，TG在肝細(xì)胞內(nèi)，一方面氧化分解供能，另一方面與載脂蛋白B100、載脂蛋白C等以及磷脂、膽固醇結(jié)合生成極低密度脂蛋白(VLDL)，由肝細(xì)胞分泌通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)輸至肝外組織。當(dāng)肝細(xì)胞合成TG增多，TG轉(zhuǎn)運(yùn)或氧化障礙時(shí)，均可導(dǎo)致TG的堆積，形成脂肪肝。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞普遍發(fā)生脂肪變性，細(xì)胞腫脹，內(nèi)含較大的脂肪滴，可將細(xì)胞核擠壓向胞膜，表明高脂環(huán)境可引起肝臟脂肪浸潤(rùn)(TG貯存)。而經(jīng)過(guò)瘦素處理后，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，與瘦素呈劑量依賴性關(guān)系。說(shuō)明10－7～10－5mol/L濃度的瘦素對(duì)離體脂肪變肝細(xì)胞有積極的防治作用。

瘦素是一種主要由白色脂肪組織分泌合成、由167個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)類激素［8］。主要在白色脂肪組織中表達(dá)，通過(guò)靶細(xì)胞膜上的受體及相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系發(fā)揮作用。OB-Rb主要存在于下丘腦中能表達(dá)NPY的細(xì)胞表面，與瘦素結(jié)合后，通過(guò)Janus激酶(JAK)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活物(STAT)蛋白發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，調(diào)控核內(nèi)DNA上leptin效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活性。瘦素與特異性運(yùn)輸?shù)鞍捉Y(jié)合，通過(guò)血腦屏障后與下丘腦特異受體結(jié)合，把體脂信號(hào)傳遞給下丘腦。下丘腦再通過(guò)一系列神經(jīng)體液因素調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝，調(diào)整體脂，控制體重相對(duì)恒定［9］。給OB小鼠腦脊液中注入瘦素后［10］，進(jìn)食明顯減少，體重逐漸下降，減少的僅為脂肪組織，且基礎(chǔ)代謝率有所升高，說(shuō)明抑制食欲、增加能耗和減少體重可能是瘦素減肥的主要機(jī)制。

瘦素可能從外周直接拮抗肝脂肪變性。瘦素可以激活A(yù)MP活化蛋白激酶，減少脂肪沉積［11］，還可特異性抑制肝臟的硬脂?；?輔酶A去飽和酶，使肝臟 VLDL生成和脂肪沉積減少［12］。Unger等［13］認(rèn)為，非脂細(xì)胞瘦素受體發(fā)生功能障礙時(shí)，細(xì)胞內(nèi)TG含量能增加100倍，而持續(xù)表達(dá)的異位高瘦素血癥能使細(xì)胞內(nèi)TG耗竭;瘦素還干預(yù)胰島素在肝臟中的作用，一方面拮抗胰島素誘導(dǎo)的PEPCK下調(diào)，抑制胰島素受體底物-1(IRS-1)的磷酸化，影響胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);另一方面，瘦素通過(guò)對(duì)PEPCK及糖異生的影響，限制TG的合成，提高肝臟及外周組織對(duì)胰島素的敏感性。Stumvoil等［14］發(fā)現(xiàn)，瘦素與脂聯(lián)素等連用，能促進(jìn)小鼠肝脂肪燃燒及能量消耗，可逆轉(zhuǎn)缺乏過(guò)氧化物酶體增殖受體(PPAR)α的脂肪萎縮小鼠的胰島素抵抗。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞內(nèi)TG明顯增加，經(jīng)過(guò)瘦素處理后，肝細(xì)胞內(nèi)TG明顯減少，與瘦素呈劑量依賴性關(guān)系。說(shuō)明瘦素能明顯減少離體脂肪變肝細(xì)胞的TG沉積，與文獻(xiàn)［12-15］報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)顯示，瘦素對(duì)離體脂肪變肝細(xì)胞具有降低細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的作用，對(duì)TG的作用明顯。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)油紅“O”染色顯示，瘦素處理后脂肪變肝細(xì)胞內(nèi)TG量明顯減少，瘦素可抑制乙酰CoA羧化酶的表達(dá)而抑制TG的合成，可見(jiàn)瘦素可使離體肝細(xì)胞內(nèi)TG合成減少，減少TG沉積，從而減輕肝細(xì)胞脂肪化程度。但其對(duì)人類非酒精性脂肪性肝臟疾病是否具有治療意義，以及具體作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

［1］周峘，滕香宇，劉偉.2型糖尿病和非酒精性脂肪肝［J］.中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2007，14(5):675-677.

［2］Day CP.Non-alcoholic steatohepatitis(NASH):where are we now and where are we going［J］.Gut，2002，50(5):585-588.

［3］郭宏，許傳芬，郭冬.非酒精性脂肪肝患者肝損害程度與代謝綜合征各組分的關(guān)系［J］.中國(guó)醫(yī)藥，2010，5(12):1139-1141.

［4］楊秉輝.非酒精性脂肪性肝病與肝癌［J］.中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)，2011，18(1):1-2.

［5］Medina J，F(xiàn)ernández-Salazar LI，García-Buey L，et al.Approach to the pathogenesis and treatment of nonalcoholic steatohepatitis［J］.Diabetes Care，2004，27(8):2057-2066.

［6］Day CP，James OF.Steatohepatitis:a tale of two“hits”［J］.Gastroenterology，1998，114(4):842-845.

［7］徐正捷，范建高，王國(guó)良，等.乳果糖對(duì)大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型形成的影響［J］.中華消化雜志，2003，23:97-100.

［8］臧謀圣，徐勝前.瘦素和瘦素受體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥，2010，5(3):281-283.

［9］鄭素梅，梁麗霞，鄭風(fēng)穎，等.瘦素與骨代謝［J］.中國(guó)醫(yī)藥，2009，4(3):238-239.

［10］Le Lay S，Boucher J，Rey A，et al.Decreased resistin expression in mice with different sensitivities to a high-fat diet［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，289［2］:564-567.

［11］Minokoshi Y，Kim YB，Peroni OD，et al.Leptin stimulates fatty-acid oxidation by activating AMP-activated protein kinase［J］.Nature，2002，415［6869］:339-343.

［12］Oral EA，Simha V，Ruiz E，et al.Leptin-replacement therapy for lipodystrophy［J］.N Engl J Med，2002，346:570-578.

［13］Uygun A，Kadayifci A，Yesilova Z，et al.Serum leptin levels in patients with nonalcoholic teatohepatitis［J］.Am J Gastraenterol，2000，95(12):3584-3589.

［14］Stumvoil M，Tschritter O，et al.Association of T-G polymorphism in adiponection(exon 2)with obesity and insulin sensitivity:interaction with family history of type 2 diabetes［J］.Diabetes，2002，51(1):37-41.

［15］張霞意，郭家偉，羅紅彬，等.非酒精性脂肪肝與血清瘦素和可溶性瘦素受體的關(guān)系［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(17):2849-2851.