瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 (瀘州 646000)劉 宏 鄧明明 王何 彩

急性重癥胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)是一種多系統(tǒng)疾病。 SAP不但累及胰腺,而且累及肝、肺及腎臟等遠(yuǎn)處器官[1]。肝臟是胰腺血液回流的第一站,病變胰腺釋放大量炎癥介質(zhì)及蛋白酶在肝臟損害中也發(fā)揮一定作用。在病變加重時(shí)可發(fā)展成為肝衰竭,一旦肝功能衰竭發(fā)生就可導(dǎo)致多器官功能障礙(MODS)的發(fā)生,使患者的病死率明顯的增加。大量的證據(jù)表明肝細(xì)胞過度凋亡可能是肝細(xì)胞功能衰竭的重要原因。細(xì)胞凋亡調(diào)控基因中最受關(guān)注的就是 Bcl-2,細(xì)胞色素 C及 fas家族。DADA是臨床常用的保肝藥,在胰腺炎肝臟損傷的治療中有確切的臨床療效。本研究利用 SAP肝臟損害大鼠模型,探討肝細(xì)胞凋亡和細(xì)胞色素 C、Bcl-2基因表達(dá)在 SAP肝臟損害發(fā)病機(jī)制中的作用以及應(yīng)用 DADA治療后的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 SD雄性大鼠 78只,體重250g～ 300g,由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成四組:正常組 6只,假手術(shù)組 24只,SAP組 24只,DADA治療組 24只。 每組再分為 12h、24h、48h、72h四個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分配 6只大鼠。

2 動(dòng)物模型的制備 大鼠采用 3%戊巴比妥鈉1ml/kg腹腔注射麻醉,平臥固定,取上腹橫切口,將胃提出腹外翻轉(zhuǎn),使胰腺組織充分暴露,小動(dòng)脈夾夾閉胰管近肝門部。SAP組及 DADA組用 4號(hào)針頭于十二指腸乳頭開口處刺破腸管進(jìn)入胰管,依次向胰管開口方向推進(jìn),緩慢推注 5%?；悄懰徕c 1ml/kg,使整個(gè)胰腺均勻隆起,去除動(dòng)脈夾,退出針頭關(guān)腹。DADA組于模型制備成功后,經(jīng)尾靜脈注射 DADA 0.375ml/(kg?12h);SAP組尾靜脈注射等劑量生理鹽水;假手術(shù)組僅翻動(dòng)胰腺組織周圍的腸管隨即關(guān)腹。造模后 12h、24h、48h、72h等各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,心臟穿刺抽血,快速切取肝臟組織,測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

3 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

3.1 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定 AST、ALT。

3.2 肝臟組織病理學(xué)觀察各組織光鏡標(biāo)本以甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋、HE染色,光鏡觀察。

3.3 肝臟細(xì)胞凋亡的測(cè)定:采用 DNA末端原位標(biāo)記法(TUNEL法,試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司)。切片常規(guī)脫蠟入水,經(jīng) 2%H2O2處理、蛋白酶 K消化后,加人 TDT和 Dig.dUTP 4℃過夜,封閉后加生物素化抗地高辛抗體 ,洗滌,加 SABC,DAB顯色,光鏡下計(jì)算肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)(Apoptotic Index,AI)。 AI計(jì)算方法:細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞,數(shù) 4個(gè)高倍視野,分別計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù),Al=凋亡細(xì)胞數(shù) /總細(xì)胞數(shù)×100。

3.4 肝臟凋亡相關(guān)基因 Bcl-2、fas、細(xì)胞色素 C的測(cè)定采用 SABC免疫組化染色法(免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司)。染色模式:胞膜或胞漿。①定性分析根據(jù)染色強(qiáng)度分為:陽性(棕黃色);弱陽性(淺黃色);陰性(不著色)。②定量分析各組切片均采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色陽性反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。具體操作為:取切片在光學(xué)顯微鏡下以相同倍數(shù)(40×10)于肝組織隨機(jī)選取 10個(gè)視野,利用圖像分析系統(tǒng)分析陽性面積和陽性區(qū)域平均灰度值,并將陽性面積和平均灰度值按文獻(xiàn)方法[2]換算成陽性單位(Positive unit,PU),以 PU值大小代表陽性產(chǎn)物表達(dá)的多少。

結(jié) 果

1 肝臟組織病理學(xué)改變

1.1 肉眼所見假手術(shù)組未見異常;SAP組 12h時(shí)腹腔見少量滲液,大網(wǎng)膜水腫,肝臟體積略增大,包膜正常;24h時(shí)腹腔內(nèi)血性腹水增多,大網(wǎng)膜明顯水腫并出現(xiàn)皂化,肝臟體積增大,包膜略緊張,與胰腺有少許的粘連;48h時(shí)腹腔內(nèi)見大量血性腹水,大網(wǎng)膜、腸系膜大片皂化,肝臟體積增大,包膜緊張,顏色稍淡,與胰腺粘連明顯,可見粘連部位肝臟組織壞死;72h時(shí)腹腔內(nèi)見大量惡臭血性腹水,大網(wǎng)膜、腸系膜大片皂化,肝臟體積明顯增大,包膜緊張,顏色明顯變淡,與胰腺粘連較重,與胰腺粘連部位肝臟組織明顯壞死;DADA組各時(shí)間點(diǎn)肝臟大體變化均較 SAP組明顯減輕。

1.2 光鏡下所見假手術(shù)組未見異常;SAP組 12h時(shí)肝細(xì)胞腫脹,細(xì)胞間隔增寬,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn);24h時(shí)肝臟組織脂肪變明顯,肝細(xì)胞腫脹加重,細(xì)胞間隔增寬,間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),紅細(xì)胞淤積;48h時(shí)可見局灶性或不規(guī)則片狀肝細(xì)胞壞死,肝竇及匯管區(qū)周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞淤積;72h時(shí)可見不規(guī)則片狀或大片肝細(xì)胞壞死,肝竇及匯管區(qū)周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及紅細(xì)胞淤積;DADA組各時(shí)間點(diǎn)鏡下所見均較 SAP組明顯減輕。

2 AST、ALT的改變 SAP時(shí) AST、ALT明顯升高,且隨著病程延長(zhǎng)而逐漸增高;應(yīng)用 DADA治療后,AST、ALT明顯下降,但仍有隨著病程延長(zhǎng)而逐漸增高的趨勢(shì),見表 1,2。

表1 各組大鼠血清 ALT變化(±s)

表1 各組大鼠血清 ALT變化(±s)

與 N組及假手術(shù)組比較,* P＜0.05;與 SAP組比較,▲ P＜0.05

ALT(U/L)組 別12h 24h 48h 72h N組 41.66± 4.59 41.66± 4.59 41.66± 4.59 41.66± 4.59假手術(shù)組 56.60± 6.02 55.63± 7.39 57.2± 9.07 54.53± 7.29 SAP組 206.35± 12.71* 248.93± 36.89* 302.33± 28.30* 317.57± 25.71*DADA組 126.30±40.31▲ 95.65±18.67▲ 87.53± 11.14▲ 60.40±22.24▲

表2 各組血清 AST變化(x-±s)

3 肝臟細(xì)胞凋亡情況 正常組及假手術(shù)組有極少量凋亡細(xì)胞,SAP組凋亡細(xì)胞明顯增多,凋亡指數(shù)升高,并隨著病程延長(zhǎng)而逐漸增高,DADA組凋亡指數(shù)較 SAP組明顯下降。各組肝臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù),見表 3。

表3 各組大鼠肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)(±s)

表3 各組大鼠肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)(±s)

與 N組及假手術(shù)組比較,* P＜0.05;與 SAP組比較,▲ P＜0.05

TUR組 別12h 24h 48h 72h N組 0.0046± 0.0007 0.0046± 0.0007 0.0046± 0.0007 0.0046± 0.0007假手術(shù)組 0.0052± 0.0010 0.0053± 0.0006 0.0053± 0.0005 0.0053± 0.0005 SAP組 0.0276± 0.0043* 0.0344± 0.0040* 0.0378± 0.0044* 0.0456± 0.0044*DADA組 0.0156± 0.0030▲ 0.0177±0.0022▲ 0.0174± 0.0021▲ 0.0123± 0.0032▲

4 肝臟細(xì)胞細(xì)胞色素 C、Bcl-2、Fas基因表達(dá)的變化 正常組及假手術(shù)組細(xì)胞色素 C、Bcl-2、Fas基因的表達(dá)均較弱;SAP組細(xì)胞色素 C、FAS基因有表達(dá),尚隨著病程延長(zhǎng)而逐漸增高,Bcl-2表達(dá)值隨著病程延長(zhǎng)而逐漸下降;DADA組與 SAP組比較,細(xì)胞色素 C、Fas基因表達(dá)明顯下調(diào),而 Bcl-2基因表達(dá)明顯上調(diào)。各組肝臟組織細(xì)胞色素 C、Bcl-2、fas表達(dá),見表 4～ 6。

表4 各組大鼠肝臟細(xì)胞細(xì)胞色素 C表達(dá)(±s)

表4 各組大鼠肝臟細(xì)胞細(xì)胞色素 C表達(dá)(±s)

與 N組及假手術(shù)組比較,* P＜0.05;與 SAP組比較,▲ P＜0.05

細(xì)胞色素 C組 別12h 24h 48h 72h N組 0.0261± 0.0020 0.0261± 0.0020 0.0261± 0.0020 0.0261± 0.0020假手術(shù)組 0.0264± 0.0046 0.0228± 0.0029 0.0315± 0.0045 0.0289± 0.0021 SAP組 0.1057± 0.0136* 0.1608± 0.0095* 0.1878± 0.0148* 0.2161± 0.0181 DADA組 0.0735± 0.0053▲ 0.0630± 0.0059▲ 0.0778± 0.0065▲ 0.0587± 0.0083▲

表5 各組大鼠肝臟細(xì)胞 Bal-2表達(dá)(±s)

表5 各組大鼠肝臟細(xì)胞 Bal-2表達(dá)(±s)

與 N組及假手術(shù)組比較,* P＜0.05;與 SAP組比較,▲ P＜0.05

Bcl-2組 別12h 24h 48h 72h N組 0.0105± 0.0010 0.0105± 0.0010 0.0105± 0.0010 0.0105± 0.0010假手術(shù)組 0.0137± 0.0018 0.0119± 0.0026 0.0108± 0.0015 0.0095± 0.0016 SAP組 0.2066± 0.0128* 0.1465± 0.0216* 0.1377± 0.0423* 0.0798± 0.0329*DADA組 0.0932± 0.0588▲ 0.2999± 00.0356▲ 0.5734± 0.0866▲ 0.6291±0.0682▲

表6 各組大鼠肝臟細(xì)胞 Fas表達(dá)(x-±s)

討 論

研究發(fā)現(xiàn)胰腺炎肝細(xì)胞損害的病理表現(xiàn)為光鏡下可見肝細(xì)胞變性、散在的液化性壞死灶,庫(kù)普弗細(xì)胞腫脹。電鏡下可見糖原顆粒減少,但脂質(zhì)小滴大小和數(shù)目增加;線粒體腫脹,其基質(zhì)和嵴變性;自噬體和溶酶體增多;肝竇內(nèi)皮損害伴吞噬細(xì)胞活性增加。 Isogai等[3]對(duì) 26例膽源性急性胰腺炎患者進(jìn)行肝穿刺活檢,大部分均有不同程度的肝臟損害。光鏡下主要的組織病理學(xué)特征為散在的肝細(xì)胞壞死和急性膽管炎;電鏡下可見肝細(xì)胞排列無序、膽小管擴(kuò)張及膽汁潴留,部分區(qū)域的 Diss間隙尚可見肝細(xì)胞內(nèi)容物。 Takeyama等[4]在體內(nèi)以 20%脫氧膽酸鈉(DCA)誘發(fā)大鼠 AP模型及健康大鼠腹腔注射胰腺炎相關(guān)性腹水(Pancreatitis associated ascitic fluid,PAAF)或在體外將不同濃度的 PAAF與原代肝細(xì)胞一起孵育,采用原位末端標(biāo)記、瓊脂糖凝膠電泳、細(xì)胞周期分析等技術(shù)檢測(cè),均發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡較對(duì)照組顯著增多。

細(xì)胞的凋亡是受基因調(diào)控的,細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因中最受關(guān)注的是 Fas/FasL基因和 Bax/Bcl-2。研究發(fā)現(xiàn) AP時(shí) Kupffer細(xì)胞衍生的 Fas配體(FasL1、p38-MAPK)、Caspase-3表達(dá)增加并且誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的凋亡損傷[5,6]。推測(cè) Fas/FasL在 AP肝細(xì)胞的凋亡中起關(guān)鍵作用。并認(rèn)為 Kupffer細(xì)胞衍生的 Fas/FasL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡和 NF-kappa B途徑誘導(dǎo)的 Kupffer細(xì)胞凋亡之間的平衡失調(diào)程度決定了 AP時(shí)肝臟損傷的程度。

Bcl-2和 Bax都是 Bcl-2家族成員,Bcl-2的生理功能主要是抑制細(xì)胞凋亡,延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。 Bcl-2與Bax可形成同二聚體或異二聚體來改變線粒體的通透性,從而決定細(xì)胞的生存與死亡。當(dāng) Bcl-2相對(duì)量高于Bax時(shí),Bcl-2同二聚體增多并促進(jìn)形成 Bcl-2-Bax異二聚體,而 Bcl-2同二聚體和 Bcl-2-Bax異二聚體都可抑制細(xì)胞凋亡;相反當(dāng) Bax的量相對(duì)高于 Bc1-2時(shí),則Bax同二聚體增多,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。因而 Bcl-2/Bax兩蛋白比例時(shí)決定細(xì)胞凋亡或存活的關(guān)鍵因素[8],而應(yīng)用 DDFA(包括 D:地塞米松,D:低分子右旋糖酐,F:5-氟脲嘧啶,A:抑肽酶)治療后,Bax基因表達(dá)明顯下調(diào),而 Bel-2基因表達(dá)明顯上調(diào),Bcl-2/Bax比值上升。因此認(rèn)為,DDFA對(duì)肝功能的保護(hù)作用可能部分是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因 Bax和 Bcl-2從而影響細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的[9]。

線粒體在肝細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用,細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激后,線粒體發(fā)生腫脹,位于線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔道(Mitochondriumpermeability transition pore,MPTP)開放,使線粒體外膜電位降低、破裂,線粒體內(nèi)細(xì)胞色素 C(Cytochrome C,Cyt C)、凋亡誘導(dǎo)因子 (Apoptosis inducing factor,AIF)、Ca2+以及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)等釋放到胞質(zhì)中,分別通過破壞核內(nèi)染色質(zhì)或激活 Caspase或作用于其它 Ca2+依賴性蛋白,而引起細(xì)胞凋亡。

線粒體通過釋放出凋亡誘導(dǎo)因子和(或)細(xì)胞色素C誘導(dǎo)凋亡。如線粒體內(nèi)膜發(fā)生損傷,則可導(dǎo)致線粒體功能的改變和肝細(xì)胞壞死。另外,一系列的單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),在缺氧或高氧的情況下,激活線粒體的滲透轉(zhuǎn)換能力能促進(jìn)細(xì)胞死亡[10]。

DADA是臨床常用的保肝藥,臨床療效確切[11]。DADA的代謝產(chǎn)物有二異丙胺和甘氨酸,其中甘氨酸能通過甘氨酸裂解酶作用生成甲基四氫葉酸(N2H10-CH4-FH4),能為肝細(xì)胞代謝提供能量;通過激活丙酮酸脫氫酶(PDH)復(fù)合物以增加 PDH活性,增加葡萄糖氧化、促進(jìn)三羧酸循環(huán)而改善肝細(xì)胞的能量代謝。同時(shí)另一代謝產(chǎn)物二異丙胺在三磷酸腺苷(AT P)活化作用下生成甲硫氨酸,甲硫氨酸與甲基四氫葉酸均可提供甲基,促進(jìn)膽堿合成。膽堿與肝脂肪作用生成卵磷脂,生成的卵磷脂能促進(jìn)膜磷脂的序貫甲基化,增強(qiáng)肝細(xì)胞膜的流動(dòng)性,提高作為膽汁分泌和流動(dòng)主要?jiǎng)恿Φ拟c-鉀-AT P酶的活性,從而促進(jìn)肝細(xì)胞再生。因此,能使受損肝細(xì)胞得到修復(fù),同時(shí)提高組織細(xì)胞呼吸功能及氧利用率,提高脂肪酸的代謝活性,加速脂肪酸的氧化,并調(diào)節(jié)肝臟能量平衡,為肝臟功能恢復(fù)創(chuàng)造條件[12]。

有報(bào)道[13],D-氨基半乳糖氨所致中毒性肝損傷模型,其肝組織病理學(xué)和生化改變與人類病毒性肝炎相似。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著病程的進(jìn)展大鼠肝細(xì)胞內(nèi)的fas基因及細(xì)胞色素 C的表達(dá)明顯的增加,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的 Bcl-2表達(dá)是降低的這與大鼠的肝細(xì)胞凋亡增加肝功能的進(jìn)一步惡化時(shí)一致的,肝細(xì)胞的凋亡與肝功能有著明顯的相關(guān)性且隨著肝細(xì)胞凋亡數(shù)目的增加肝功能進(jìn)一步的惡化。說明胰腺炎的肝臟損害存在著肝細(xì)胞及線粒體的能量代謝障礙,而肝臟的損害至少部分是通過凋亡產(chǎn)生的。而采用 DADA治療以后大鼠的肝功能得到明顯的改善 AST、ALT明顯的下調(diào),同時(shí)細(xì)胞凋亡基因 fas、細(xì)胞色素 C表達(dá)明顯的降低而凋亡抑制因子 Bcl-2表達(dá)明顯的上調(diào),病理結(jié)果顯示肝臟損害明顯的減輕,肝細(xì)胞凋亡指數(shù)也明顯的降低;說明DADA能夠改善肝細(xì)胞的能量代謝抑制細(xì)胞凋亡基因 fas、細(xì)胞色素 C的表達(dá),促進(jìn)凋亡抑制因子 Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù),對(duì) SAP導(dǎo)致的肝臟損害起到保護(hù)作用。

我們認(rèn)為 SAP時(shí)隨著肝細(xì)胞和線粒體能量代謝障礙 fas和細(xì)胞色素 C表達(dá)明顯上升,Bcl-2的表達(dá)下調(diào),肝臟凋亡細(xì)胞數(shù)增多,肝功能進(jìn)一步惡化;DADA能夠改善肝細(xì)胞及線粒體的能量代謝使細(xì)胞色素 C表達(dá)下調(diào)同時(shí)使凋亡基因 fas基因表達(dá)明顯下調(diào),而 Bcl-2基因表達(dá)明顯上調(diào),減少肝臟細(xì)胞凋亡可明顯改善肝功能。因此認(rèn)為,DADA對(duì)肝功能的保護(hù)作用可能部分是通過改善肝細(xì)胞代謝,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因 fas、細(xì)胞色素 C和 Bcl-2的表達(dá)來抑制 SAP時(shí)肝細(xì)胞的過度凋亡實(shí)現(xiàn)的。

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(注:*鄧明明為本文通訊作者)