張 紅綜述，李偉彥審校

0 引 言

慢性疼痛仍然是臨床治療難點，目前治療主要靠非類固醇類抗炎藥及麻醉性鎮(zhèn)痛劑等，但往往效果不佳，且?guī)碓S多不良反應(yīng)。因此，尋找一種安全有效、作用持久、經(jīng)濟方便、不良反應(yīng)小的鎮(zhèn)痛方法已成為人們感興趣的課題。隨著分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，靶向輸注轉(zhuǎn)基因治療引起了人們極大的興趣。作為外周傷害性刺激傳遞的第1站，脊髓初級傷害性感受器成為主要靶點，操作簡便，未直接干預(yù)到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，避免了一系列潛在的中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)［1］。轉(zhuǎn)基因載體主要有非病毒載體和病毒載體，HSV-I可感染迄今所知的所有哺乳動物細胞類型，具有嗜神經(jīng)特性，可在神經(jīng)系統(tǒng)中經(jīng)突觸順行或逆行傳播，是一個能提供大量克隆能力及表達大量轉(zhuǎn)基因的載體，在慢性疼痛基因治療中具有廣闊的前景。

1 HSV-I的生物學(xué)特性

HSV-I是有包膜的大的雙鏈DNA病毒，屬皰疹病毒α亞科，通過接觸傳播，在皮膚、黏膜感染和復(fù)制，由感覺神經(jīng)元末端攝取，通過逆向軸漿運輸至脊髓DRG的核周體，可傳遞約150000bp的外源DNA至增殖和靜止的哺乳細胞核內(nèi)，使其成為慢性疼痛基因轉(zhuǎn)染和基因治療最有興趣的載體家族。HSV-I的特性主要有4個方面:①病毒質(zhì)粒容量大。②病毒DNA以附著體形式存在，未整合至宿主細胞染色體上，與被感染神經(jīng)元建立長期親合關(guān)系，降低了插入突變的風(fēng)險。③病毒基因組的復(fù)雜性，容納了約40個非必需基因，其缺失不影響病毒在宿主細胞的復(fù)制。④天然嗜神經(jīng)系統(tǒng)的能力，以順行和逆行軸漿運輸?shù)男问?，在神?jīng)元之間經(jīng)過突觸傳播，且能夠在神經(jīng)元建立長期潛伏感染狀態(tài)，處于病毒感染潛伏期的神經(jīng)元不被病毒免疫反應(yīng)排斥，顯示正常功能。病毒基因根據(jù)其對病毒感染復(fù)制的影響，可分為必需基因和非必需基因。構(gòu)建病毒載體的方法主要從病毒中去除不必要的基因，使其本身不能復(fù)制和表達蛋白產(chǎn)物，但保留接觸和轉(zhuǎn)導(dǎo)基因組入宿主細胞的能力。利用HSV-I的特性，構(gòu)建的HSV-I載體可分為3類，見圖1。①減毒重組體:攜帶減弱毒力的基因突變體有復(fù)制及突變能力，但傳播缺陷，在癌細胞可以復(fù)制，對健康組織無毒性，它們主要用作溶瘤病毒。②復(fù)制缺陷、不致病的重組病毒型載體:選擇性刪除1個或更多的復(fù)制必需基因，立早基因(immediate early genes，IEG)，如感染細胞多肽 ICP4、ICP27、ICP22、ICP47，或控制其表達，保留病毒基因轉(zhuǎn)錄激活必需的ICP0。缺失的必需基因功能由互補細胞反式提供，刪除了病毒裂解功能，建立了類似于潛伏期的穩(wěn)定狀態(tài)，不可能重新激活，但保留了野生型HSV-I靶向DRG的特征，在中樞或者外周神經(jīng)元建立潛伏狀態(tài)后能長期表達轉(zhuǎn)基因物質(zhì)。③擴增子載體(質(zhì)粒型載體):由1個來源于HSV-I復(fù)制(orcs)和包裝信號(pac)的質(zhì)粒組成，是一種完全缺損病毒，不含有HSV-I編碼基因，不合成任何病毒蛋白，對宿主細胞完全無毒性，對轉(zhuǎn)染機體無病源性，容量大，有利于轉(zhuǎn)運長達150 000 bp的轉(zhuǎn)基因序列［2］，但需要輔助病毒參與包裝，存在輔助病毒神經(jīng)毒性可能。目前，在慢性疼痛轉(zhuǎn)基因治療中主要使用后2種載體形式。

圖1 HSV-I的3種載體形式Figure 1 Three vectors derived from HSV-I

2 阿片肽及受體基因的轉(zhuǎn)染

2.1 增加阿片肽的表達 阿片受體存在于脊髓初級傷害性傳入神經(jīng)元末端的突觸前間隙和脊髓背角二級神經(jīng)元的突觸后間隙，自然狀態(tài)下受體激活主要是內(nèi)源性腦腓肽和內(nèi)嗎啡肽(Endomorphin，EM)，或阿片類藥物如嗎啡，抑制脊髓水平疼痛信號的傳導(dǎo)。HSV-I載體轉(zhuǎn)染腦腓肽基因治療疼痛，已在不同動物模型上得到驗證:①在炎性痛的研究上，大鼠足底注射攜帶腦腓肽或前腦腓肽基因的HSV-I重組體，逆行轉(zhuǎn)導(dǎo)至DRG，表達的腦腓肽，降低了高敏C纖維的反應(yīng)及與慢性炎性痛相關(guān)的熱痛和機械痛敏，亦降低了甲醛炎性痛延遲相的傷害性反應(yīng)。在完全氟式佐劑引起多關(guān)節(jié)炎的大鼠慢性痛模型中，不僅緩解了疼痛，還阻止了關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，推測可能是由于關(guān)節(jié)外周感覺神經(jīng)元末端腦腓肽釋放的結(jié)果［3］。在靈長類獼猴足背接種表達腦腓肽的HSV-I載體，降低了A-δ和C纖維介導(dǎo)的疼痛相關(guān)反應(yīng)，為人類臨床試驗治療慢性疼痛奠定了基礎(chǔ)。②在神經(jīng)病理性疼痛的研究上，脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation，SNL)模型及眶下神經(jīng)結(jié)扎的顱面痛模型，HSV-I載體介導(dǎo)腦腓肽的表達均產(chǎn)生了很好的鎮(zhèn)痛效果，且能與嗎啡的作用累加(降低了嗎啡的ED50)。③在內(nèi)臟痛的研究上，表達腦腓肽的HSV-I載體，減弱了辣椒素導(dǎo)致的膀胱興奮及膀胱功能亢進，降低了急、慢性胰腺炎大鼠胰腺的炎性反應(yīng)［4］;另外，癌性痛既有炎性痛亦有神經(jīng)病理性疼痛，在小鼠的骨癌疼痛模型中，載體介導(dǎo)腦腓肽的表達，有很好的鎮(zhèn)痛效果。這些載體最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)的時間窗是1周，其后隨著時間衰退，與輔助病毒人類巨細胞病毒IE基因啟動子(human cytomegalovirus IE promoter，HCMV IEp)插入驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達的時間窗是一致的。4周后再接種病毒載體又恢復(fù)了鎮(zhèn)痛效應(yīng)，不產(chǎn)生耐受，沒有明顯對載體的免疫應(yīng)答。

除了腦腓肽外，對其他抑制性神經(jīng)遞質(zhì)亦有研究，如EM-2，內(nèi)源性高度選擇性μ受體激動劑，皮下注射表達EM-2的HSV-I載體至SNL大鼠足底，降低了機械性異常痛和熱痛敏，選擇性μ受體拮抗劑納洛酮可阻斷這一效應(yīng)［5］，在甲醛和完全氟式佐劑炎性痛模型的延遲相，也有效減輕了疼痛行為，抑制了脊髓C-fos(原癌基因)的表達［6］。

2.2 減少μ受體的表達 用HSV-I載體來調(diào)控初級傳入感覺神經(jīng)元μ受體的表達有相似效果。皮膚應(yīng)用表達反義μ受體cDNA的HSV-I載體，減少了μ受體的表達，降低了內(nèi)源性腦腓肽對C纖維的反應(yīng);相反，應(yīng)用表達μ受體基因的HSV-I載體，增加了初級感覺傳入神經(jīng)元的應(yīng)答反應(yīng)，表明轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的μ受體在外周感覺神經(jīng)元末端表達的作用［7］。

3 離子通道蛋白基因的轉(zhuǎn)染

RNA技術(shù)的發(fā)展，使降低內(nèi)源性基因的表達變成可能，離子通道可能是基因治療最合理的靶點。電壓依賴性鈉離子通道NaV1.7是第1個被研究的，皮膚應(yīng)用編碼NaV1.7反義寡核苷酸的HSV-1載體，可以減輕痛敏。編碼靶向NaV1.8鈉離子通道鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制劑，體外減少了蛋白轉(zhuǎn)錄，體內(nèi)降低了神經(jīng)病理性疼痛大鼠的傷害性行為［8］。

HSV-I載體還可用于探測慢性疼痛傷害性神經(jīng)元的生理變化本質(zhì)及載體介導(dǎo)的效應(yīng)機制。有學(xué)者設(shè)計HSV-I載體來研究離子通道功能變化的信號通路，發(fā)現(xiàn)其對通道激活和疼痛信號產(chǎn)生高反應(yīng)。辣椒素受體1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)的激活僅與疼痛相關(guān)，用HSV-I載體鑒定完整的TRPV1離子通道調(diào)節(jié)遞質(zhì)的方法正在研究中［9］。占主導(dǎo)地位的負性 PKCε的表達，干擾TRPV1離子通道易位至細胞膜表面，抑制了辣椒素導(dǎo)致的熱敏反應(yīng)［10］。HSV-I介導(dǎo)的腦腓肽在DRG的持續(xù)表達，逆轉(zhuǎn)了糖尿病神經(jīng)病理性痛的電壓依賴性鈉離子通道Nav1.7的增加。這些實驗都是基于HSV-I載體，來研究逆轉(zhuǎn)慢性疼痛信號傳遞中傷害性感受器功能的變化［11］。

4 抗炎介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)染

脊髓水平炎癥激活在慢性疼痛的形成過程中起了重要作用［12］。最近有研究用HSV-I載體表達抗炎遞質(zhì)調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)炎性反應(yīng)，減少疼痛的神經(jīng)傳導(dǎo)［13］。在脊髓激活的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞釋放的促炎性物質(zhì)中，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factoralph-α，TNF-α)起了重要作用。在大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中，腹腔注射TNF受體p55TNFR的中和抗體，降低了熱痛敏和機械性異常痛，而鞘內(nèi)注射重組p75sTNFR肽(伊那西普，TNF-α拮抗劑)降低了機械性異常痛［14］。因長期全身使用這種免疫調(diào)節(jié)遞質(zhì)存在一定的風(fēng)險，Hao等［15］檢測了慢性疼痛中短肽p55sTNFR的作用，足底皮下注射后，載體介導(dǎo)的p55sTNFR在DRG的釋放減少了神經(jīng)病理性疼痛行為，同時減少抑制了p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)磷酸化、白細胞介素-1β(IL-1β)及膜相關(guān)TNF-α的表達。另外，在下胸段脊髓半切斷的中樞神經(jīng)病理性疼痛的動物模型中，也得到了相似的結(jié)果。IL-4是經(jīng)典的抗炎性遞質(zhì)，皮下注射表達IL-4的HSV-I載體，不能改變正常動物的疼痛閾值，但明顯減輕了神經(jīng)病理性疼痛動物模型的機械性異常痛，逆轉(zhuǎn)了熱痛敏，阻滯了 IL-1β增加和p38MAPK磷酸化，并減少了自身腦腓肽的產(chǎn)生。注射編碼抗炎性遞質(zhì)IL-10的非復(fù)制載體，減少了甲醛炎性痛延遲相的疼痛相關(guān)行為，這個作用與下調(diào)脊髓小膠質(zhì)細胞TNF-α的表達是一致的［16］。

5 其他疼痛相關(guān)介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)染

在神經(jīng)病理性疼痛的形成和發(fā)展過程中，脊髓腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)的改變也起了重要作用［17］。在部分坐骨神經(jīng)損傷的神經(jīng)病理性疼痛模型中，直接鞘內(nèi)注射GDNF，可減少異位神經(jīng)放電率和疼痛相關(guān)行為，注射表達GDNF的載體產(chǎn)生的抗異常痛作用持續(xù)好幾周，其轉(zhuǎn)基因表達是由HCMV Iep驅(qū)動的，可通過再接種載體重新建立［18］。γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其激動劑非靶向引起的鎮(zhèn)靜效應(yīng)，使其在疼痛治療中的應(yīng)用受到限制，但轉(zhuǎn)基因載體局部應(yīng)用可避免這一缺欠。谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarborylase，GAD)使谷氨酸脫羧產(chǎn)生GABA，皮下注射表達GAD的HSV-I載體，在SNL模型中，明顯降低了機械性異常痛和熱痛敏。表達GAD的HSV-I載體也減少了脊髓半切斷中樞神經(jīng)病理性疼痛模型的疼痛相關(guān)行為，其效應(yīng)可由鞘內(nèi)注射GABA受體拮抗劑阻斷，表明載體的鎮(zhèn)痛效應(yīng)是由脊髓GABA(A)、GABA(B)受體介導(dǎo)的［19］。降鈣素在疼痛傳導(dǎo)中起重要作用，編碼反義降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)的HSV-I，降低了DRG中CGRP的表達，同時也伴有體內(nèi)傷害性神經(jīng)傳遞的減少［20］。

6 臨床進展

臨床前實驗為應(yīng)用HSV-I載體治療慢性疼痛提供了循證依據(jù)。相關(guān)的臨床研究顯示，注射有復(fù)制能力的HSV-I減毒重組體溶瘤病毒，至腦部的腫瘤(成膠質(zhì)細胞瘤)、乳腺癌、肝癌及皮膚癌，均無嚴重的毒副作用產(chǎn)生，未激活內(nèi)源性HSV，未引起腦膜炎，也未從注射局部向其他部位傳播，提示皮膚注射無復(fù)制能力的HSV-I重組型載體可能是安全的，為我們臨床應(yīng)用HSV-I治療慢性疼痛奠定了基石。第Ⅰ期用無復(fù)制能力，攜帶前腦腓肽原基因的HSV-I載體治療晚期癌痛患者的臨床實驗，已于2008年2月獲得美國美國食品和藥物管理局的批準，7月份通過美國密西根大學(xué)機構(gòu)審查委員會的審查，現(xiàn)臨床試驗正在進行中，旨在檢測載體的安全性，其有效性要在接下來炎性痛的研究上進一步證實［21］。另外，編碼GAD的HSV-I載體治療糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的臨床試驗，已經(jīng)獲得國際健康組織重組DNA咨詢委員會的批準，現(xiàn)正在前期準備階段，而編碼EM-2的HSV-I載體治療炎性痛，也已正式提上日程［22］。

7 問題與展望

慢性疼痛仍是危害健康的主要疾病，缺少有效的干預(yù)措施，HSV-I載體轉(zhuǎn)基因治療慢性疼痛的一系列臨床前動物研究，其有效性已得到證實，如果這個治療過程被證明對人類是安全有效的，它將最終幫助那些不能忍受現(xiàn)有止痛藥的不良反應(yīng)，或不能從現(xiàn)有藥物中得到充分緩解的患者。但進一步研究，仍有問題亟待解決:①人的皮膚神經(jīng)分布密度比動物低，DRG轉(zhuǎn)導(dǎo)效率需進一步研究。②即使強啟動子HCMV Iep驅(qū)動載體轉(zhuǎn)基因表達也僅持續(xù)幾周，這需要反復(fù)注射病毒載體，限制了其臨床應(yīng)用，需要開發(fā)更好的驅(qū)動基因。③處于潛伏狀態(tài)的HSV-I載體是否會感染神經(jīng)節(jié)，重新進入裂解周期。④體內(nèi)預(yù)先存在抗HSV-I抗體的患者是否限制了皮下注射HSV-I的有效性。我們相信，HSV-I載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，能夠成功的從動物研究過渡到一種可行的疼痛治療的臨床手段。

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