劉錫強， 李 麗， 田京偉

(1.淄博市中心醫(yī)院干?？疲綎|淄博255036;2.煙臺大學藥學院，山東 煙臺264000)

迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是1958年由Elis首次從唇形科植物迷迭香中分離得到，是水溶性多酚類化合物，在植物中的分布較為廣泛，主要存在于唇形科、紫草科、葫蘆科、椴樹科、傘形科的多種植物中［1-2］。國內(nèi)外的研究證明，迷迭香酸是一種具有多功能的天然活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理學作用［3］。本實驗通過建立大鼠冠脈結(jié)扎心肌缺血模型，觀察迷迭香酸對心肌缺血保護作用的相關(guān)指標，從而探討其可能機制，為中藥開發(fā)治療心血管疾病提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠120只，體質(zhì)量(250±30)g，由山東綠葉制藥天然藥物研發(fā)中心提供。

1.2 藥物與試劑 迷迭香酸實驗樣品由山東綠葉天然藥物研發(fā)中心藥理實驗室提供，純度為99.7%，硝酸異山梨酯(齊魯制藥有限公司，規(guī)格:10 mL:10 mg，批號:08110382);SOD試劑盒、MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，兔抗鼠多克隆抗體(bcl-2、bax):武漢博士德生物工程有限公司;UltraSensitiveTMS-P免疫組化染色試劑盒:福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備 取60只雄性Wister大鼠為A組，另取60只為B組，A、B各組隨機分為假手術(shù)組(生理鹽水10 mg/kg)、缺血模型組(生理鹽水10 mg/kg)、硝酸異山梨酯組(20 mg/kg)，迷迭香酸小劑量組(50 mg/kg)，迷迭香酸中劑量組(100 mg/kg)，迷迭香酸高劑量組(200 mg/kg)。各組給藥體積均按20 mL/kg口服給予相應(yīng)濃度藥液，1次/d，連續(xù)灌胃5 d。大鼠連續(xù)灌胃給藥5 d后，以100 mg/L水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，仰位固定。自胸骨左側(cè)3～4肋間縱行切開皮膚2 cm，分離筋膜及肌層，于心尖搏動明顯處撥開肋間隙輕壓右側(cè)胸廓擠出心臟，在左心耳根部下方，即肺動脈圓錐及左房間找出冠狀動脈左前降支，除假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎外，其它各組在距起點2～3 mm處穿一“0”號絲線結(jié)扎，迅速將心臟復(fù)位，立即縫合胸壁使自主呼吸恢復(fù)，整個手術(shù)在30 s內(nèi)完成。各組大鼠造模后2 h進行以下實驗。

2.2 細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)量的測定 將A組大鼠心肌細胞沉淀加入冷的勻漿緩沖液，倒入玻璃勻漿管，插在冰水混合物中充分轉(zhuǎn)動研磨。然后將心肌細胞勻漿液離心3000 r/min，4℃，15 min。取勻漿上清液，按試劑盒說明檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物SOD活性和MDA量。

2.3 免疫組織化學方法觀察心肌細胞bcl-2，bax蛋白表達取B組大鼠心尖部心肌，至10%福爾馬林溶液中固定24 h，經(jīng)80%的乙醇溶液遞增充分脫水后，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚的石蠟切片，供光鏡觀察及細胞凋亡檢測。按試劑盒說明書進行。胞漿內(nèi)著棕黃色或褐色顆粒者為蛋白表達陽性細胞。在光學顯微鏡下觀察心肌缺血周圍區(qū)的bcl-2、bax的陽性細胞，采用病理圖像分析系統(tǒng)對切片進行圖像分析，測定每組切片bcl-2、bax免疫組化染色的平均光密度值和陽性細胞數(shù)。按照如下公式計算心肌細胞免疫組化陽性表達指數(shù)(PEI):PEI=平均光密度×陽性細胞百分率。

3 結(jié)果

3.1 迷迭香酸對心肌缺血大鼠心肌細胞SOD和MDA的影響 與假手術(shù)組比較，缺血模型組大鼠血清SOD活性降低(P＜0.05)、MDA 量升高(P＜0.05)。與缺血模型組比較，迷迭香酸大中小劑量組大鼠血清SOD活性增高、MDA量降低，并隨著迷迭香酸劑量的增加，血清SOD呈升高趨勢、MDA量呈降低趨勢。ID組大鼠血清SOD活性也升高(P＜0.05)、MDA量亦見降低(P＜0.05)。結(jié)果表明迷迭香酸能劑量依賴性降低結(jié)扎冠狀動脈誘發(fā)的心肌缺血大鼠細胞MDA量，增加SOD活性(見表1)。

表1 迷迭香酸對心肌缺血大鼠心肌細胞SOD、MDA及bcl-2，bax蛋白的影響(±s，n=10)

表1 迷迭香酸對心肌缺血大鼠心肌細胞SOD、MDA及bcl-2，bax蛋白的影響(±s，n=10)

注:與缺血模型組比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與假手術(shù)組比較△P ＜0.05 △△P ＜0.01。

組別 劑量/(mg/kg) SOD(u/mg) MDA/(nmol/mg蛋白) bcl-2/% bax/%假手術(shù)組 - 4.51 ±1.49 7.76 ±1.41 15.0 ±3.8＊＊ 3.90 ±0.8＊＊心肌缺血組 - 1.93±0.68△ 12.88±1.79△ 20.4±3.9 30.5±6.1△△迷迭香酸小劑量組 50 2.56 ±0.57 11.36 ±1.94 23.1 ±3.9 22.3 ±3.8*迷迭香酸中劑量組 100 2.74±0.79* 11.05±1.34* 26.1±4.5△ 15.1±2.3＊△迷迭香酸大劑量組 200 3.12±0.91* 10.59±1.82* 28.3±4.2△ 10.1±2.4＊＊△ID 組 20 3.62 ±1.08＊＊ 10.11 ±2.84＊＊ 24.5 ±3.6 18.9 ±3.7＊△

3.2 缺血心肌細胞bcl-2，bax蛋白表達的檢測 免疫組化染色結(jié)果顯示所有組別心肌細胞均有bcl-2，bax蛋白表達，假手術(shù)組bcl-2，bax蛋白表達量較少，染色呈淺棕色。與假手術(shù)組比，缺血模型組bax蛋白表達明顯升高(P＜0.01)。迷迭香酸各給藥組bcl-2，bax蛋白的表達量比假手術(shù)組有所增加，但bax明顯較缺血模型組低(P＜0.05或 P＜0.01)。與假手術(shù)組比較ID組bax蛋白表達升高(P＜0.05)，與缺血模型組比較ID組bcl-2蛋白表達無明顯差異性，bax蛋白表達減少(P ＜0.05)(見表1)。

4 討論

在心肌缺血時，兒茶酚胺在缺血區(qū)大量積蓄，經(jīng)代謝可產(chǎn)生大量的氧自由基，在發(fā)生自氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量的超氧陰離子和過氧化氫增加自由基水平。這些活性氧自由基可直接作用于心肌細胞膜而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，促進MDA生成增多及SOD活力降低。MDA是由自由基產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，已普遍用作檢測機體組織中自由基水平的指標;SOD是體內(nèi)最重要的抗氧化酶，可反映機體抗氧化系統(tǒng)的功能。所以同時檢測MDA量和SOD活性可了解自由基產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)的功能狀態(tài)［4］。迷迭香酸可使心肌細胞中MDA量降低、SOD活力顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)，說明其對心肌缺血性損傷的保護作用可能與提高抗氧化酶活性，降低自由基水平，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。

心肌缺血時，心肌組織不僅缺氧和代謝障礙，同時毒性產(chǎn)物蓄積，引起缺血性損傷，若繼續(xù)發(fā)展導(dǎo)致心肌細胞死亡。近年來，普遍認為細胞死亡有兩種機制，即壞死和凋亡。細胞凋亡是一種主動性的基因控制的細胞死亡形式，在正常的生長發(fā)育及許多疾病的發(fā)生中起著非常重要的作用。凋亡的啟動與抑制受多種內(nèi)源性及外源性信號的刺激［5］，而且在其發(fā)生過程中，有許多因子的參與。其中促凋亡基因與抗凋亡基因bcl-2被認為與細胞凋亡關(guān)系密切。bax是bcl-2家族的一個成員，它具有獨立于其它基因以外的細胞毒作用，可不依賴激活和抑制相關(guān)基因而誘導(dǎo)細胞凋亡。相反，bcl-2的抗凋亡作用一部分是通過抑制bax的細胞毒作用而實現(xiàn)的。本實驗中Tunel染色進一步驗證了心肌缺血損傷可導(dǎo)致凋亡細胞明顯增多，免疫組化結(jié)果亦提示與對照組比較，缺血模型組bax陽性細胞表達明顯增加，bcl-2亦有一定程度增加。目前抑制細胞凋亡的措施并不太多，有研究認為β受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑及某些中藥對細胞凋亡有抑制作用［6-7］。近年來，隨著傳統(tǒng)醫(yī)學的發(fā)展，中藥在心血管疾病中的作用越來越受到重視。本實驗中迷迭香酸是山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心通過結(jié)構(gòu)改造獲得的一個單體化合物，經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造后增加了其水溶性及穩(wěn)定性。實驗中與缺血模型組比較，迷迭香酸給藥組細胞凋亡數(shù)目明顯減少，免疫組化結(jié)果同時表明迷迭香酸能上調(diào)抗凋亡因子bcl-2和下調(diào)促凋亡因子bax的表達，說明迷迭香酸抗心肌缺血的機制可能與其對凋亡基因的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

［1］劉鷹翔，計志忠.迷迭香酸藥理作用的研究進展［J］.國外醫(yī)藥植物分冊，1993，8(6):248-251.

［2］Chen Jianghong，Ho Chitang.Antioxidant activities of caffeic Acid and Its Related Hydroxycinnamic Acid Compounds［J］.J Agric Food Chem，1997，45(7):2374-2378.

［3］陳立亞.迷迭香酸的研究概況［J］.中國藥事，2007，21(11):923-926.

［4］李 林，黃松明，趙三龍，等.氧化應(yīng)激對大鼠腎臟系膜細胞增生的影響及迷迭香酸的干預(yù)作用［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，16(25):3627-3629.

［5］Thomnson CB.Apoptos is in the pathogenesis and treatment of diease［J］.Seienee，1995，267:1456-1462.

［6］常志文，劉 琦.缺血再灌注心肌細胞凋亡及藥物干預(yù)［J］.中國新藥雜志，2000(9):28-30.

［7］張 萍，林敬明，孝志粱，等.復(fù)方丹參注射渣對兔急性心肌梗塞細胞凋亡的影響［J］.中藥材，2001(24):502-504.