孔 祥， 張道友， 張 妍， 吳海兵， 李芳霞

(皖南醫(yī)學(xué)院1藥理學(xué)教研室，國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，2弋磯山醫(yī)院腎內(nèi)科，3弋磯山醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是以胰島素抵抗為病理生理基礎(chǔ)，伴有中心性肥胖、高血脂、高血壓、糖尿病或空腹血糖增高的癥候群，已經(jīng)成為危害人類生命健康的全球性問題［1］。近年來研究證實(shí)MS不僅是心、腦血管疾病的危險(xiǎn)因素，亦可導(dǎo)致腎臟損傷。文獻(xiàn)報(bào)道MS能夠引起進(jìn)行性腎小球硬化，增高白蛋白尿和慢性腎病的發(fā)病率［2］。但是，MS腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其主要原因之一是缺乏能充分模擬臨床特征的動(dòng)物模型。

目前，長期飲食誘導(dǎo)(高脂和/或高糖喂飼)是建立MS大鼠模型的一種常用方法［3］。此方法建立的模型能夠模擬人類MS大多數(shù)特征，但未見腎臟功能和結(jié)構(gòu)損傷的報(bào)道。實(shí)際上，長期攝入單純高脂、高糖飲食能否引起腎臟損傷尚存在爭議［4，5］。然而，有文獻(xiàn)報(bào)道高鹽攝入可引起大鼠高胰島素血癥、高血壓和腎臟損傷［6］。因此，我們通過長期高脂高鹽飲食和高糖飲水喂飼Sprague－Dawley(SD)大鼠，以期建立一種MS腎病動(dòng)物模型。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種刺激時(shí)，自由基產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)失衡的一種病理狀態(tài)，在高血脂、高血壓和糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起著不可忽視的作用［7］。然而氧化應(yīng)激在MS腎病中的作用未見相關(guān)報(bào)道。故本研究在建立MS腎病大鼠模型的基礎(chǔ)上，探討腎臟中氧化應(yīng)激的狀態(tài)、產(chǎn)生機(jī)制及其對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 葡萄糖、甘油三酯(triglyceride，TG)和總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;白蛋白和胰島素(insulin，Ins)放免試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所;尿蛋白、肌酐、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAOC)、抑制超氧陰離子能力(inhibiting superoxide anion capacity，ISAC)、丙 二 醛 (malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Cu/Zn－SOD、NADPH氧化酶亞單位 p47phox和 p22phox抗體購自 Santa Cruz;β－actin抗體購自武漢博士德公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;ECL試劑盒購于Pierce。

1.2 動(dòng)物和飼料 7周齡雄性SD大鼠20只，體重200－240 g，購自浙江省試驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(浙)20080033。大鼠飼料購自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。高脂高鹽(high－fat and high－salt，HFS)飼料配方見作者之前報(bào)道［8］。(1)正常飼料(g·kg－1):蛋白質(zhì)217，碳水化合物462，脂肪44，纖維素80，氯化鈉4，混合礦物質(zhì)24，混合維生素2。HFS飼料(g·kg－1):蛋白質(zhì) 211，碳水化合物 330，脂肪200(含15%豬油和1%膽固醇)，纖維素65，氯化鈉40，混合礦物質(zhì)24，混合維生素2。(2)飼料熱量組成和密度如下:正常飼料，蛋白質(zhì)占總熱量27.8%，碳水化合物 59.3%，脂肪 12.8%，3.1 kCal·g－1;HFS飼料，蛋白質(zhì)21.3%，碳水化合物45.4%，脂肪33.3% ，4.0 kCal·g－1。

2 方法

2.1 模型建立及處理 大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠1只，室溫(22～24)℃，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)1周后隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組(control，n=10，給于普通飼料和正常飲水)和模型組(MS，n=10，給于 HFS飼料和20%蔗糖飲水)。2組大鼠按此條件持續(xù)喂養(yǎng)20周。每周測量1次體重(body weight，BW)。每4周用ALC－NIBP無創(chuàng)血壓測定系統(tǒng)，測清醒狀態(tài)下大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)［8，9］。于20周末代謝籠收集24 h尿液后，大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清。稱內(nèi)臟脂肪(visceral fat weight，VFW)和腎臟濕重(kidney weight，KW)，計(jì)算其占體重比值。取部分腎臟用10%甲醛固定，用于PAS和Masson染色。其余凍存于－80℃冰箱備用。

2.2 血清和尿液指標(biāo)檢測 酶比色法測血清TC、TG和空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)含量，放射免疫法測血清空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)Ins)水平，計(jì)算穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)(homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA －IR)=［FBG(mmol/L)× FIns(mU/L)/22.5］［10］。除蛋白法測血清和尿肌酐含量，并計(jì)算肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)=［尿肌酐(μmol/L)×24 h尿量(mL)/血肌酐(μmol/L)］×［1000/BW(g)］×［1/1440(min)］［11］。Bradford 法測尿蛋白含量，計(jì)算尿蛋白排泄率(urinary protein excretion，UPE)。放射免疫法測尿白蛋白水平，并計(jì)算尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAE)。電極法測定尿鈉含量，并計(jì)算尿鈉排泄率(urinary sodium excretion，USE)。

2.3 腎組織生化指標(biāo)檢測 將腎組織剪碎后置于勻漿器，加入RIPA裂解液和混合蛋白酶抑制劑，反復(fù)碾碎組織，4℃ 12000×g離心15 min，取上清用Bradford法測蛋白濃度。采用比色法測腎勻漿TAOC和抗超氧陰離子能力、MDA含量以及SOD、CAT和GPX活性。

2.4 Western blotting 檢測腎臟 p47phox、p22phox和 Cu/Zn－SOD蛋白表達(dá) 以80 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)SDS－PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)膜至NC膜，室溫封閉2 h。洗膜后分別加入Ⅰ抗(p47phox1∶800，p22phox1∶500，Cu/Zn －SOD 1∶1000，β －actin 1∶500 稀釋)4℃孵育過夜。洗膜后Ⅱ抗37℃孵育1.5 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，拍攝照片。根據(jù)積分吸光度(integrated absorbance，IA)值對(duì)比分析條帶強(qiáng)弱，以βactin為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析。

2.5 腎臟病理檢查 切片常規(guī)脫蠟脫水，PAS和Masson染色后光鏡觀察腎小球硬化(glomerulosclerosis，GS)和腎小管間質(zhì)損傷(tubulointerstitial injury，TI)。TI判斷標(biāo)準(zhǔn)包括:皮質(zhì)區(qū)腎間質(zhì)纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤和腎小管擴(kuò)張或萎縮。采用盲法半定量評(píng)估 GS 和 TI程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下［12，13］:0 分，正常;1分，病變面積＜25%;2分，面積26% ～50%;3分，面積51% ～75%;4分，面積＞76%。每張切片至少觀察50個(gè)腎小球(×400)和皮質(zhì)區(qū)視野(×100)，并計(jì)算其評(píng)分平均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 兩組大鼠一般狀況的比較

入選分組時(shí)兩組大鼠BW無明顯差別［(267.1±10.5)g vs(269.5 ±14.6)g，P ＞0.05］。20 周時(shí)，MS大鼠BW、VFW、VFW/BW和KW較正常大鼠明顯增高(P＜0.05)。MS大鼠KW/BW與正常大鼠無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

入選分組時(shí)兩組大鼠SBP無明顯差別［(120.2±8.9)mmHg vs(118.8 ±8.4)mmHg，P ＞0.05］。8周時(shí)MS大鼠SBP升高［(139.6±9.3)mmHg vs(125.9±8.2)mmHg，P＜0.05］。20周時(shí) MS大鼠SBP［(149.4±9.4)mmHg］明顯高于正常大鼠［(119.3 ±8.6)mmHg，P ＜0.05］，見圖1。

表1 兩組大鼠一般狀況的比較Table 1.Comparison of physiological parameters in the two groups(.n=10)

表1 兩組大鼠一般狀況的比較Table 1.Comparison of physiological parameters in the two groups(.n=10)

*P ＜0.05 vs control group.

Group BW(g) VFW(g) KW(g)VFW/BW(mg·g－1)KW/BW(mg·g－1)Control 558.8 ±35.1 16.0±2.0 2.52 ±0.32 28.7±4.2 4.51±0.51 MS 657.2 ±55.1*46.8±7.9* 3.26 ±0.42* 71.0±9.8*4.97±0.61

Figure 1.Comparison of SBP in the two groups..n=10.*P＜0.05 vs MS group.圖1 兩組大鼠SBP的比較

2 兩組大鼠血脂、血糖、胰島素水平和穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)的比較

MS大鼠TC和TG明顯高于正常大鼠(P＜0.05)。兩組大鼠血清FBG無明顯差別(P＞0.05)。MS大鼠血清FIns水平和HOMA－IR較正常大鼠顯著增高(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠TC、TG、FBG、FIns和HOMA－IR的比較Table 2.Comparison of TC，TG，F(xiàn)BG，F(xiàn)Ins and HOMA－IR in the two groups(.n=10)

表2 兩組大鼠TC、TG、FBG、FIns和HOMA－IR的比較Table 2.Comparison of TC，TG，F(xiàn)BG，F(xiàn)Ins and HOMA－IR in the two groups(.n=10)

*P ＜0.05 vs control group.

Group TC(mmol·L－1)TG(mmol·L－1)FBG(mmol·L－1)FIns(mU·L－1)HOMA－IR Control 1.42 ±0.65 0.88±0.29 5.33 ±0.49 38.7±22.1±7.19.9 9.2±2.4 MS 2.50 ±0.70*1.48±0.41*5.99 ±0.95 82.3±14.9*

3 兩組大鼠尿鈉、蛋白和白蛋白排泄率及肌酐清除率的比較

兩組大鼠UPE和Ccr無顯著差異(P＞0.05)。MS大鼠 USE和UAE較正常大鼠明顯增高(P＜0.05)，見表 3。

4 兩組大鼠腎臟T－AOC、ISAC和MDA含量的比較

MS大鼠腎臟T－AOC和ISAC較正常大鼠顯著降低(P＜0.05)，MDA含量顯著增加(P＜0.05)，見表4。

表3 兩組大鼠USE、UPE、UAE和Ccr的比較Table 3.Comparison of USE，UPE，UAE and Ccr in the two groups(.n=10)

表3 兩組大鼠USE、UPE、UAE和Ccr的比較Table 3.Comparison of USE，UPE，UAE and Ccr in the two groups(.n=10)

*P ＜0.05 vs control group.

Control 1.1 ±0.4 7.0 ±2.4 13.3±3.7 2.55 ±0.92 MS 15.1±2.5* 11.2±6.0 39.5±9.5*1)2.77 ±0.84

5 兩組大鼠腎臟抗氧化酶活性的比較

MS大鼠腎臟SOD活性顯著低于正常大鼠(P＜0.05)，GPx和 CAT活性兩組間無顯著差異(P＞0.05)，見表 4。

6 兩組大鼠腎臟 p47phox、p22phox和 Cu/Zn－SOD蛋白表達(dá)的比較

MS大鼠腎臟p47phox蛋白表達(dá)(0.63±0.11)較正常大鼠顯著增高(0.34±0.08，P＜0.05)，Cu/Zn－SOD蛋白表達(dá)(0.50±0.07)較正常大鼠顯著降低(0.83±0.12，P＜0.05)。兩組大鼠 p22phox蛋白表達(dá)無明顯差別(0.31±0.08 vs 0.21±0.05，P＞0.05)，見圖2。

表4 2組大鼠腎臟T－AOC、ISAC、MDA含量和抗氧化酶活性的比較Table 4.Comparison of renal T－AOC，ISAC，MDA level and antioxidant enzyme activities in the two groups(.n=10)

表4 2組大鼠腎臟T－AOC、ISAC、MDA含量和抗氧化酶活性的比較Table 4.Comparison of renal T－AOC，ISAC，MDA level and antioxidant enzyme activities in the two groups(.n=10)

*P ＜0.05 vs control group.

Group T－AOC(103U·g－1protein)ISAC(103U·g－1protein)MDA(μmol·g－1protein)SOD(103U·g－1protein)GPX(103U·g－1rotein)CAT(103U·g－1protein)Control 4.99 ±1.40 101.2 ±15.9 4.87 ±0.68 150.9 ±31.3 24.1 ±6.4 20.9 ±2.5 MS 2.48 ±0.45* 69.9 ±11.5* 7.74 ±1.51* 92.5 ±19.7*21.9 ±5.8 21.4 ±2.6

Figure 2.Renal protein expression of p47phox，p22phoxand Cu/Zn －SOD in the two groups.Representative bands and integrated absorbance(IA)normalized to the corresponding βactin were shown..n=4.*P ＜0.05 vs control group.圖2 兩組大鼠腎臟p47phox、p22phox和Cu/Zn－SOD蛋白表達(dá)的比較

7 兩組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)比較

MS大鼠腎臟腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生，基質(zhì)增多，GS評(píng)分(1.10±0.25)較正常大鼠(0.18±0.07)明顯升高(P＜0.05)。MS大鼠未見明顯腎間質(zhì)纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤和腎小管擴(kuò)張或萎縮，TI評(píng)分兩組間無顯著差異，見圖3。

Figure 3.Representative micrographs of the kidneys in control(A)and MS(B)rats(PAS staining，×400).圖3 PAS染色觀察兩組大鼠腎臟組織形態(tài)改變

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，予以HFS飼料和高糖飲水20周后，SD大鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量、血脂、血壓明顯增高，且伴有顯著胰島素抵抗，說明MS模型制備成功。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠腎臟濕重、UAE和GS評(píng)分亦顯著升高，UPE、Ccr和腎臟濕重占體重比值有增高趨勢，TI評(píng)分無顯著變化，提示MS大鼠伴有早期的腎臟功能和結(jié)構(gòu)損傷。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)等產(chǎn)生過多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。ROS主要包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等，其中超氧陰離子可與NO結(jié)合生成一種極為強(qiáng)大的氧化劑過氧亞硝酸鹽陰離子，導(dǎo)致自由基反應(yīng)加劇，加重組織損傷［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MS大鼠腎臟T－AOC和抗超氧陰離子能力較正常大鼠降低，MDA含量增加，說明ROS在MS腎病大鼠生成明顯增多。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在MS大鼠腎臟，超氧陰離子主要來源之一的NADPH氧化酶亞單位p47phox蛋白表達(dá)明顯增加。上述結(jié)果提示NADPH氧化酶活化，生成大量超氧陰離子，進(jìn)而激活各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是導(dǎo)致MS大鼠腎臟損傷的可能機(jī)制。

機(jī)體清除ROS的主要抗氧化酶系統(tǒng)包括SOD、GPx和CAT。SOD主要作用是清除超氧陰離子，GPx和CAT主要清除過氧化氫。文獻(xiàn)報(bào)道在各種ROS中，過氧化氫和NO等具有非常重要的信號(hào)作用，毒性作用很弱，而羥自由基和超氧陰離子毒性強(qiáng)，是導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷的主要介質(zhì)［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MS大鼠腎臟SOD活性和Cu/Zn－SOD蛋白表達(dá)較正常大鼠明顯降低，提示超氧陰離子清除減少亦是導(dǎo)致MS大鼠腎臟損傷的可能機(jī)制。

綜上所述，長期HFS飲食和高糖飲水喂飼SD大鼠可建立具有大部分臨床特征的MS腎病大鼠模型。NADPH氧化酶表達(dá)增高和SOD表達(dá)減少而引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)在MS大鼠腎臟損傷的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。

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