張日佳， 陳 劍△， 宋子宣， 王彥平

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院眼科，2醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

糖尿病性眼表損害是糖尿病最為常見的并發(fā)癥之一，但其病變機(jī)制至今仍不十分清楚。近年來，有關(guān)糖尿病氧化應(yīng)激學(xué)說的報(bào)道越來越多［1－3］，糖尿病時(shí)活性氧蓄積和氧自由基反應(yīng)明顯增強(qiáng)，不但引起視網(wǎng)膜病變，也是眼表病變發(fā)生的可能機(jī)制之一。

同型半胱氨酸又稱高半胱氨酸(homocysteine，Hcy)，在金屬離子的存在下直接或間接氧化產(chǎn)生、H2O2、OH·等氧自由基，起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的直接損害。Hcy還能激活炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子核因子κB(nuclear factor kappa B，NF－κB)，通過NF－κB通路進(jìn)行調(diào)控，刺激白細(xì)胞介素6(interleukin－6，IL－6)的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)。目前人們主要應(yīng)用高效液相色譜分析法來測定血漿中的游離Hcy和總Hcy水平，對于機(jī)體其它組織或體液中的Hcy水平未見有研究報(bào)道。分析Hcy水平與糖尿病性眼表損害及糖尿病性視網(wǎng)膜病變之間的相互聯(lián)系，旨在進(jìn)一步探索糖尿病造成的眼表組織損害的可能機(jī)制，為防治糖尿病性眼部并發(fā)癥提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 主要儀器和試劑 惠普公司Angilen 100系列高效液相色譜儀+熒光檢測器及ODS Hypersil色譜分離柱;標(biāo)準(zhǔn)品 Hcy、內(nèi)標(biāo)胱胺、TCEP［tris(2－carboxyethyl)phosphine］購自Sigma，熒光衍生劑SBDF(7－fluorobenzo－2－oxa－1，3－diazole－4－sulphate)購于Fluka，三氯乙酸購自天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，其余試劑為國產(chǎn)分析純或光譜純。

1.2 病人資料 我院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病患者(均符合1980年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn))40例為病例組，共80眼，其中男21例，女19例;年齡45～75歲，平均(58.68±7.33)歲。于我院眼科選取體檢的正常健康人(性別、年齡匹配)40例為對照組，80眼，其中男21例，女19例，年齡47～74歲，平均(59.15±7.20)歲。

2 方法

2.1 收集血漿樣品 所有實(shí)驗(yàn)對象均采清晨空腹靜脈血3 mL，2%EDTA抗凝，30 min內(nèi)離心分離出血漿(2500×g離心10 min)，－20℃保存。

2.2 收集淚液樣品 實(shí)驗(yàn)對象取平臥位，采血的同時(shí)用細(xì)棉簽刺激中鼻甲附近黏膜引起反射性淚液分泌，在內(nèi)眥部淚阜處汲取淚液，共取200 μL。

2.3 應(yīng)用高效液相色譜結(jié)合熒光檢測分析法來測定血漿及淚液中的 Hcy水平 Pfeiffer等［4］報(bào)道了14個(gè)不同國家、地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室(共8種不同的測定方法)協(xié)作測定相同血漿樣品Hcy，結(jié)果表明，用“TCEP+SDB－F”組合的高效液相色譜結(jié)合熒光檢測分析法批間變異最小。高效液相色譜結(jié)合熒光檢測分析法的兩個(gè)關(guān)鍵步驟是Hcy的還原以及熒光衍生。TCEP是一種新的性質(zhì)穩(wěn)定、使用方便的Hcy還原劑;SDB－F是巰基特異性熒光衍生劑，用其對測試樣品中的Hcy、谷胱甘肽等含巰基化合物進(jìn)行柱前衍生;“TCEP+SDB－F”組合使得本實(shí)驗(yàn)具有更高的敏感性和特異性［5］，且無干擾峰。胱胺為含巰基化合物，不存在于血漿及淚液，不與血漿中其它物質(zhì)發(fā)生明顯化學(xué)反應(yīng)，熒光衍生效果良好，是一個(gè)合適的內(nèi)標(biāo)，以其參與反應(yīng)體系，可與所要檢測的物質(zhì)(Hcy)產(chǎn)生隨同變化，減少實(shí)驗(yàn)誤差及變異。測定時(shí)設(shè)置全空白對照品、單品Hcy對照及單品胱胺對照，可明確Hcy及內(nèi)標(biāo)胱胺所在的光譜峰。

制備80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125μmol/L Hcy標(biāo)準(zhǔn)品工作液。然后進(jìn)行樣品處理，取50 μL待測品(血漿、Hcy標(biāo)準(zhǔn)品)，與 25 μL 10 μmol/L 胱胺溶液、25 μL PBS(pH 7.4)混合，加入 100 g/L TCEP 10 μL，室溫下作用30min。加入含1 mmol/L EDTA的100g/L三氯乙酸90 μL，13000 ×g 離心 10 min。取上清液 50 μL，加至含以下混合物的自動(dòng)進(jìn)樣器小管中:1.55 mol/L NaOH 10 μL，0.125 mol/L 硼 酸 鹽 緩 沖 液 (含4 mmol/L EDTA，pH 9.5)125 μL，1.0 g/L SDB － F(硼酸鹽緩沖液中)50 μL。60℃溫育60 min后上機(jī)(惠普公司Angilen 100系列高效液相色譜儀+熒光檢測器 )進(jìn)行測試，每次進(jìn)樣量為20 μL。色譜條件設(shè)定為，流動(dòng)相:25 mmol/L KH2PO4(pH 2.5)∶甲醇=95∶5;流速:0.5 mL/min;色譜柱:Hypersil ODS C18(250 mm ×4 mm，5 μm 填充顆粒);柱溫:40 ℃;熒光檢測波長:激發(fā)波長為385 nm，發(fā)射波長為515 nm。取 0.625、0.3125、0.15625 μmol/L Hcy 標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)樣品處理后分別上樣做最低檢測限測試;取1.25～80 μmol/L Hcy標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以Hcy與內(nèi)標(biāo)胱胺的色譜峰面積比對Hcy的濃度作線性回歸分析，結(jié)果表明Hcy濃度在0.078125～40.0 μmol/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2=0.9996。經(jīng)方差分析(ANOVA)，回歸的均方=12.646，F(xiàn)=10391.481，P＜0.01，因此認(rèn)為Hcy濃度與Hcy與內(nèi)標(biāo)胱胺的色譜峰面積比之間有良好的直線關(guān)系。直線回歸方程為Y=0.09199X－0.011，回歸系數(shù)t檢驗(yàn)t=101.939，P＜0.01(與方差分析一致)，因此認(rèn)為回歸系數(shù)有顯著意義。標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)包含0.078125～40.0 μmol/L 10個(gè)濃度點(diǎn)。根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線測得樣品中Hcy含量。

2.4 分別對兩組研究對象依次進(jìn)行角膜敏感度測定、Schirmer I試驗(yàn)、淚膜破裂時(shí)間(breaking up time，BUT)側(cè)定、角膜熒光素染色及結(jié)膜虎紅染色。

2.5 以眼底熒光血管造影確診糖尿病性視網(wǎng)膜病變的分期。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 臨床資料

2型糖尿病患者組與健康對照組年齡差異無顯著(P＞0.05)，且兩組中不同性別的年齡差異亦無顯著(病例組P＞0.05;對照組P＞0.05)。糖尿病視網(wǎng)膜病變根據(jù)眼底熒光血管造影的結(jié)果按照糖尿病視網(wǎng)膜病變國際分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷和分期，病例組40例患者中I期16只眼，II期15只眼，III期13只眼，IV期12只眼，V期24只眼。

2 高效液相色譜分析法所得色譜分離曲線

通過對照單胱胺(cystamine)、單 Hcy及內(nèi)標(biāo)cystamine的Hcy標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分離曲線可得出cystamine的保留時(shí)間為8.496 min，Hcy的保留時(shí)間為8.064 min，因此在色譜分離曲線上可見保留時(shí)間8 min后先后出現(xiàn)的2個(gè)波峰分別為Hcy和cystamine，見圖1。

Figure 1.Chromatograph separation curves of Hcy.A:plasma Hcy of diabetic patients;B:plasma Hcy of control;C:tear Hcy of diabetic patients;D:tear Hcy of control;LU:luminance unit.圖1 Hcy色譜分離曲線

3 2型糖尿病患者組與對照組淚液與血漿Hcy含量

2型糖尿病患者組淚液Hcy為(0.327±0.107)μmol/L，對照組淚液 Hcy為(0.224±0.020)μmol/L，兩組間差異顯著P＜0.01。2型糖尿病患者組血漿Hcy為(18.750±7.858)μmol/L，對照組Hcy為(8.446±2.793)μmol/L(檢測結(jié)果符合文獻(xiàn)報(bào)道的健康人群 Hcy的正常值范圍［6］)，兩組間差異顯著，P ＜0.01。

4 對照組淚液與血漿Hcy含量的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)分析，對照組淚液與血漿Hcy含量之間的Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.675，P＜0.01，顯示正常人淚液Hcy含量與血漿Hcy含量間呈正相關(guān)。

5 2型糖尿病患者組淚液、血漿Hcy含量與糖尿病視網(wǎng)膜病變程度間的相關(guān)性分析

經(jīng)偏相關(guān)分析，2型糖尿病患者組淚液與血漿Hcy含量之間的 Pearson相關(guān)系數(shù) r=0.911，P＜0.01;血漿Hcy含量與糖尿病視網(wǎng)膜病變程度間的Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.548，P＜0.01;淚液Hcy含量與糖尿病視網(wǎng)膜病變程度間的Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.630，P＜0.01。當(dāng)糖尿病視網(wǎng)膜病變程度控制時(shí)，淚液與血漿Hcy含量之間呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù) r=0.871，P ＜0.01。

6 淚液、血漿Hcy含量與年齡的相關(guān)性分析

不論是2型糖尿病患者還是正常人的淚液及血漿中Hcy的含量均與其年齡無相關(guān)性，見表1。

表1 兩組淚液、血漿Hcy含量與年齡的相關(guān)性分析Table 1.Pearson correlation analysis between age and Hcy concentration in the two groups

7 角膜敏感度檢查結(jié)果

糖尿病患者的角膜上5個(gè)不同部位的敏感度均較正常對照組顯著降低。兩組的角膜敏感度均為中央部最敏感，下方角膜敏感度最差。而糖尿病組的角膜敏感度在角膜的不同部位均較對照組降低，且降低的幅度以顳、鼻、上、下側(cè)四周較中央部更顯著。

8 2型糖尿病患者組淚液Hcy含量與角膜敏感度之間的關(guān)系

角膜知覺計(jì)測量值的單位為mg/mm2，表示該部位的角膜感覺神經(jīng)感受到外界刺激時(shí)每mm2所需的質(zhì)量，該數(shù)值越大說明角膜敏感度越低，兩者呈反比例關(guān)系。Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，2型糖尿病患者淚液Hcy含量與角膜知覺計(jì)測量值的相關(guān)系數(shù)為:0.512(角膜中心區(qū))、0.648(顳側(cè)角膜)、0.524(鼻側(cè)角膜)、0.632(上方角膜)和 0.634(下方角膜)，相關(guān)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)。此結(jié)果提示，淚液Hcy含量與角膜敏感度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即淚液中Hcy含量越高，其角膜敏感度越低。

9 Schirmer I試驗(yàn)與BUT檢查

2型糖尿病患者組Schirmer I試驗(yàn)值較對照組顯著減低，且隨糖尿病視網(wǎng)膜病變程度的加重，Schirmer I試驗(yàn)值下降程度越明顯。糖尿病組的淚膜破裂時(shí)間亦較對照組顯著縮短，且隨糖尿病視網(wǎng)膜病變程度的加重，BUT值呈下降趨勢，兩者間呈負(fù)相關(guān)。

10 角膜熒光素染色及結(jié)膜虎紅染色檢查結(jié)果

2型糖尿病患者組角膜熒光素染色及結(jié)膜虎紅染色的陽性率及染色程度均較對照組顯著增高，且隨糖尿病視網(wǎng)膜病變程度的加重，患者角膜熒光素染色及虎紅染色程度總體呈升高趨勢，兩者間呈正相關(guān)。

討 論

Hcy是與半胱氨酸同系的四碳含硫氨基酸，在細(xì)胞內(nèi)由蛋氨酸代謝脫去甲基后形成，是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，胰島素對Hcy代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。大量的研究和文獻(xiàn)報(bào)道Hcy是心腦及外周血管病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，并且Hcy水平與糖尿病有關(guān)［7，8］，有研究表明血中 Hcy水平的增高可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙，繼而促進(jìn)微循環(huán)障礙及微血栓形成［9］，而研究者從體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于葉酸缺乏而導(dǎo)致的半胱氨酸的水平增高可誘發(fā)神經(jīng)干細(xì)胞死亡［10］，且孕婦在懷孕期間維生素B12缺乏可致胎兒血中同型半胱氨酸水平升高并增加神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷發(fā)生率［11］，由此得到提示，Hcy的升高與糖尿病外周神經(jīng)的損害存在一定相關(guān)性。糖尿病性視網(wǎng)膜病變是是臨床最為常見和嚴(yán)重的糖尿病眼部并發(fā)癥之一，隨著人們對生活質(zhì)量要求的不斷提高，糖尿病性眼表損害在近年來逐漸引起人們的重視。多年來大量的研究其中也包括我們之前的研究［12－17］證明，糖尿病眼表損害主要表現(xiàn)為角膜敏感度下降、淚液質(zhì)量異常、淚液分泌減少、結(jié)膜鱗狀化生、杯狀細(xì)胞減少甚至缺失。但糖尿病眼表損害的機(jī)制至今仍不十分清楚。Dogru等［15］認(rèn)為糖尿病患者的眼表改變與血糖的控制情況及周圍神經(jīng)病變有關(guān)。Inoue等［14］認(rèn)為糖尿病角膜上皮病變是糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病變和高糖狀態(tài)下角膜上皮和基底膜代謝異常的結(jié)果。

既往對Hcy與糖尿病之間的研究均采集患者的血液樣品，本研究除了檢測2型糖尿病患者組和對照組血漿中的Hcy水平，還首次檢測了淚液中的Hcy水平，結(jié)果顯示糖尿病組血漿、淚液中的Hcy水平均較對照組升高，并且血漿Hcy和淚液Hcy水平存在正相關(guān)，且隨著糖尿病視網(wǎng)膜病變程度的加深呈升高趨勢。2型糖尿病患者出現(xiàn)角膜敏感度下降、淚液分泌減少、淚膜不穩(wěn)定等眼表改變，和之前的研究結(jié)果相一致［12－16］。而本研究結(jié)果顯示糖尿病患者周邊的角膜敏感度下降程度較中央部更顯著，這與眼表淚液更多分布、接觸周邊角膜的生理特點(diǎn)相符，這提示我們淚液中的Hcy含量升高很可能直接參與了糖尿病眼表病變過程。根據(jù)Hcy的特性，我們推測糖尿病眼表損害的機(jī)制可能為:角膜結(jié)膜上皮和結(jié)膜杯狀細(xì)胞由于淚液中Hcy氧化應(yīng)激損傷而凋亡，造成眼表損害;淚腺毛細(xì)血管由于血漿中的Hcy水平的升高，使血管壁內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的直接損害，造成內(nèi)皮細(xì)胞脫落，使淚腺血液供給減少，淚液的分泌減少，從而造成淚腺分泌功能障礙;淚液中Hcy水平的增高直接損傷角膜三叉神經(jīng);由于角膜上皮細(xì)胞的營養(yǎng)主要來自淚液，淚液中Hcy升高，使上皮細(xì)胞的代謝受到影響，并且使其受到氧化損傷，致使細(xì)胞死亡，造成眼表損傷;淚液Hcy升高也可能促使眼表的炎癥因子產(chǎn)生，參與眼表炎癥。綜上所述，淚液中的Hcy增高可能是造成糖尿病眼表損害的其中一個(gè)因素，而其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行論證。對2型糖尿病患者淚液中Hcy水平的檢測是否能成為監(jiān)控糖尿病眼表病變的一項(xiàng)指標(biāo)，以及對血漿和淚液中的高Hcy進(jìn)行干預(yù)性治療，如葉酸及維生素B12干預(yù)能否減輕糖尿病的眼部并發(fā)癥損害均需進(jìn)一步研究。

［1］Elhadd TA，Kennedy G，Hill A.Abnormal markers of endothelial cell activation and oxidative stress in children，adolescents and young adults with type 1 diabetes with no clinical vascular disease［J］.Diabetes Metab Res Rev，1999，15(6):405 －411.

［2］Kedziora－Kornatowska K.Effect of angiotensin convertase inhibitors and AT1 angiotensin receptor antagonists on the development of oxidative stress in the kidney of diabetic rats［J］.Clin Chim Acta，1999，287(1 －2):19 －27.

［3］何劍峰，鮑連云，仇宜解.糖尿病視網(wǎng)膜組織中自由基防御機(jī)能變化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國糖尿病雜志，1997，5(3):160 －163.

［4］Pfeiffer CM，Huff DL，Smith J，et al.Comparison of plasma total homocysteine measurements in 14 laboratories:an international study［J］.Clin Chem，1999，45(8 Pt 1):1261－1268.

［5］戴崇文，張廣森，伍賢平，等.高效液相色譜－熒光檢測法測定血漿總同型半胱氨酸濃度［J］.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，27(6):556 －558.

［6］Ueland PM，Refsum H，Stabler SP，et al.Total homocysteine in plasma or serum:methods and clinical applications［J］.Clin Chem，1993，39(9):1764 －1779.

［7］周靈麗，盧文凱.2型糖尿病患者血漿總同型半胱氨酸水平與大血管病變的關(guān)系［J］.中國糖尿病雜志，2003，11(4):265 －267.

［8］Hanson NQ，Aras O，Yang F，et al.C677T and A1298Cpolymorphisms of the methylenetetrahydrofolate reductase gene:incidence and effect of combined genotypes on plasma fasting and post－methionine load homocysteine in vascular disease［J］.Clin Chem，2001，47(4):661 －666.

［9］孫 娟，譚紅梅，程 超，等.高同型半胱氨酸誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙促進(jìn)微循環(huán)障礙和微血栓形成［J］.中國病理生理雜志，2007，23(12):2336 －2340.

［10］Zhang XM，Huang GW，Tian ZH，et al.Folate deficiency induces neural stem cell apoptosis by increasing homocysteine in vitro［J］.J Clin Biochem Nutr，2009，45(1):14－19.

［11］Couto FD，Moreira LM，Dos Santos DB，et al.Folate，vitamin B12and total homocysteine levels in neonates from Brazil［J］.Eur J Clin Nutr，2007，61(3):382 － 386.

［12］Goebbels M.Tear secretion and film function in insulin dependent diabetics［J］.Br J Ophthalmol，2000，84(1):19－21.

［13］Nepp J，Abela C，Polzer I，et al.Is there a correlation between the severity of diabetic retinopathy and keratoconjunctivitis sicca?［J］.Cornea，2000，19(4):487 －491.

［14］Inoue K，Kato S，Ohara C，et al.Ocular and systemic factors relevant to diabetic keratoepitheliopathy［J］.Cornea，2001，20(8):798 －801.

［15］Dogru M，Katakami C，Inoue M.Tear function and ocular surface changes in noninsulin－dependent diabetes mellitus［J］.Ophthalmology，2001，108(3):586 －592.

［16］張日佳，陳 劍，徐錦堂，等.糖尿病性眼表病變的臨床研究［J］.中國實(shí)用眼科雜志，2006，24(3):254－257.

［17］陳 劍，黃建艷，唐福星，等.糖尿病早期角膜組織的超微變化［J］.中國病理生理雜志，2003，19(7):942－945.