王 偉 張 狄 浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 杭州 310053周大興 劉 瑤 浙江中醫(yī)藥大學藥學院

支氣管哮喘是由IgE介導的，多種炎癥細胞、炎癥介質和細胞因子參與形成的慢性氣道炎癥。嗜酸性粒細胞（EOS）是哮喘炎癥的關鍵細胞，通過釋放GM-CSF、IL-5等多種細胞因子發(fā)揮延遲凋亡、增加浸潤的作用從而維持呼吸道炎癥的存在。本實驗擬通過建立豚鼠過敏性哮喘模型，觀察小青龍湯對哮喘豚鼠血清IgE水平和肺組織IL-5和GM-CSF基因表達量的影響，探討其緩解哮喘氣道炎癥反應的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 健康雄性荷蘭種豚鼠48只，體重（200±10）g，普通級。浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號碼：SCXK(滬)2008-0016。

1.2 藥品與試劑 小青龍顆粒（湖北紐蘭藥業(yè)有限公司，批號20090201）；氨茶堿注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批號200805122）；GradeⅡ卵清蛋白（北京生物技術有限公司，批號9006-59-1）；Guinea pig IgE ELISA kit（美國R＆D Systems，批號20091222）；TaKaRa RNAiso plus ，TaKaRa primescriptTMRT-PCR kit， TaKaRa Agarose MS-6（寶生物工程有限公司）；DEPC（美國sigma分裝，批號20071006）；引物由上海生工生物工程技術服務公司合成，各引物基因序列：β-actin上游引物 5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG-3’，下游引物5’-GAGGTCCTTACGGATGTCAACG-3’，產(chǎn)物長度為464bp；IL-5上游引物5’- AGCTCTGGCAACACTATTCC-3’，下游引物5’-GGTCTCAGCCTTCAATTGTC-3’，產(chǎn)物長度為163bp；GM-C S F上游引物 5’-ATGCCACCATCAATGAAGCC-3’，下游引物5’-CAAAAGGGATAGCAAACAGAA-3’，產(chǎn)物長度為307bp。

1.3 實驗儀器 402型超聲霧化器（上海四菱醫(yī)療器械廠）；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）； JY92-超聲波細胞粉碎機/隔音箱（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LAS 4000 ImageQuant（日本富士公司）；S1000TM Thermal Cycler（美國BIO RAD公司）；AllegraTM64R Centrifuge（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Forma -86C ULT Freezer（Thermo ELECTRON CORPORATION）；PAC 300多功能水平電泳槽（美國BIO RAD公司）；680型酶標儀（美國BIO RAD公司）；核酸蛋白分析儀（美國BIO RAD公司）。

2 實驗方法

2.1 分 組 健康雄性荷蘭種豚鼠48只，隨機分為6組：正常對照組、哮喘模型組、氨茶堿組、小青龍湯高劑量組、小青龍湯中劑量組、小青龍湯低劑量組，每組8 只。

2.2 模型制備與給藥[1]實驗第1天，除正常對照組外，其他5組動物分別一次性腹腔注射10%OVA 1mL致敏，正常對照組用生理鹽水代替。各給藥組自致敏后一天起，至最后一次激發(fā)當天，每天灌胃給藥治療，共17天。氨茶堿組予氨茶堿注射液，50mg/kg；小青龍湯高劑量組予小青龍顆粒溶液，4.5g/kg；小青龍湯中劑量組予小青龍顆粒溶液，1.5g/kg；小青龍湯低劑量組予小青龍顆粒溶液，0.5g/kg；哮喘模型組和空白對照組給予生理鹽水灌胃治療。

第15天開始，除正常對照組外，其余各組在給藥1h后吸入1%OVA超聲霧化液引喘，以出現(xiàn)煩躁、嗆咳、明顯的腹肌收縮、點頭呼吸為哮喘指征；空白對照組用生理鹽水激發(fā)，每天1次，共3天。

2.3 血清IgE含量測定 各組動物于末次激發(fā)后，3%戊巴比妥納 1.5mL/kg腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血，于高速冷凍離心機3000r/min，離心15min后，取上清，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中IgE含量。具體操作按照試劑盒說明書進行，于450nm處測定。

2.4 肺組織IL-5和GM-CSF基因表達量測定[2]各組動物于末次激發(fā)后，3%戊巴比妥納 1.5mL/kg腹腔注射麻醉，打開胸腔， 分離氣管和肺臟，取下肺葉，鹽水洗去殘血，濾紙吸干。取左肺于-80℃冰箱保存待用。

2.4.1 肺組織總RNA提取 取約100mg豚鼠肺組織于1.5mL Eppendorf管中，迅速加入1.0mL的

Trizol溶液，將組織超聲粉碎后，靜置5min。①每1mLTrizol中加0.2mL氯仿。蓋緊樣品管蓋，顛倒混勻后，12 000rmp離心15min；②將上層水相轉入新的1.5mLEP管中（350μL），加入等體積異丙醇，混勻后12 000rmp離心10min；③倒掉上清，留取沉淀。加入0.5mL現(xiàn)配的75%的乙醇（DEPC-H2O配制共1mL，預冷），蓋緊蓋子后搖晃管子，使沉淀懸浮于乙醇中，7 500rmp離心5min；④倒掉上清，留取沉淀，置于吸水紙上吸干殘余液體并使其自然干燥。再在管中加50μL的0.1%DEPC水溶解；⑤新的1.5mLEP管中加入590μL DEPC處理水，另加入已溶解的RNA溶液10μL（稀釋60倍），混勻后核酸蛋白分析儀測定RNA含量以及260nm和280nm下吸光度值，并計算比值。

2.4.2 逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法擴增IL-5、GM-CSF基因 取總RNA，按照RT-PCR試劑盒說明書進行內參基因β-actin 和目的基因IL-5、GM-CSF 的擴增。反應結束后將目的基因擴增產(chǎn)物7μL和內參基因擴增產(chǎn)物3μL進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果采用凝膠圖像處理系統(tǒng)對條帶掃描，并用Image-Proplus 5.0 軟件進行半定量分析：目的基因相對表達量=平均目的基因條帶光強度/平均內參基因條帶光強度。

2.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用（±s）表示，選用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 小青龍湯對哮喘豚鼠血清中IgE含量的影響與模型組相比，小青龍湯低劑量和中劑量組血清中IgE的含量顯著降低（P＜0.05）；而小青龍湯高劑量組血清中IgE含量降低更為顯著（P＜0.01），其作用程度與氨茶堿組相似。但與正常對照組相比，小青龍湯低劑量組和中劑量組雖然降低了血清中IgE的含量，但仍未恢復正常水平；而小青龍湯高劑量組血清中IgE的含量降至正常。小青龍湯降低血清中IgE含量的作用呈濃度依賴性，見表1。

表1 小青龍湯對哮喘豚鼠血清IgE含量的影響（±s） μg/L

表1 小青龍湯對哮喘豚鼠血清IgE含量的影響（±s） μg/L

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01

組 別 n/只 IgE正常對照組 8 53.93±6.16模型組 8 107.20±15.68*氨茶堿組 8 54.09±8.22△小青龍湯低劑量組 8 79.01±13.98*△小青龍湯中劑量組 8 67.47±7.86*△小青龍湯高劑量組 8 52.56±7.00△△

3.2 小青龍湯對哮喘豚鼠肺組織中IL-5 mRNA、GM-CSF mRNA表達的影響 與模型組比較，小青龍湯低劑量和中劑量組可降低IL-5基因表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），小青龍湯高劑量組降低了IL-5基因表達量更為顯著（P＜0.01），其作用程度與氨茶堿組相似；小青龍湯各劑量對降低GM-CSF基因表達的作用具有顯著性差異（P＜0.05），其作用程度與氨茶堿相似。但與正常對照組比較，小青龍湯低劑量組雖然降低了IL-5基因和GM-CSF基因的表達量，但仍未降至正常水平；而小青龍湯中、高劑量組的IL-5基因和GM-CSF基因的表達水平降至正常量。提示小青龍湯有抑制IL-5基因和GM-CSF基因表達量的作用，且作用呈濃度依賴性，見表2、圖1、2。

表2 各組肺組織中IL-5和GM-CSF mRNA表達量（± s，n=3）

表2 各組肺組織中IL-5和GM-CSF mRNA表達量（± s，n=3）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

IL-5 mRNA表達量 GM-CSF mRNA 表達量組 別 IL-5 β-actin 相對強度 GM-CSF β-actin 相對強度（強度） （強度） （強度） （強度）正常對照組 131 71 1.8547±0.2584 107 50 2.1320±0.0409模型組 158 52 3.0644±0.1276** 165 54 3.0383±0.2495*氨茶堿組 130 73 1.8018±0.2566△△ 113 53 2.145±0.1937△△小青龍湯低劑量組 124 47 2.6408±0.1760**△ 140 54 2.6014±0.1627*△小青龍湯中劑量組 116 53 2.2620±0.3659△ 124 52 2.3598±0.0757△小青龍湯高劑量組 128 71 1.7954±0.1766△△ 106 47 2.2635±0.3131△

圖1 各組IL-5和β-actin mRNA的表達（從左到右marker、模型組、正常對照組、氨茶堿組、小青龍湯低劑量組、中劑量組、高劑量組）

圖2 各組GM-CSF和β-actin mRNA的表達（從左到右小青龍湯高劑量組、中劑量組、低劑量組、氨茶堿組、模型組、正常對照組、marker）

4 討論

支氣管哮喘是由免疫球蛋白E(IgE)介導、多種炎性細胞參與的氣道慢性炎癥。目前認為嗜酸性粒細胞（EOS）是氣道變應性炎癥反應的主要效應細胞，其他細胞多數(shù)通過EOS 而產(chǎn)生效應。近年研究發(fā)現(xiàn)EOS 聚集增加和凋亡延遲是肺內EOS 浸潤的重要因素，而減少肺內EOS 浸潤則促進哮喘氣道炎癥的消退[3-5]。

EOS能通過自分泌形式產(chǎn)生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素5（IL-5）、白介素3（IL-3）等多種細胞因子，從而增強細胞活力，延遲細胞凋亡發(fā)生，導致EOS數(shù)量增多、呼吸道炎癥持續(xù)存在。其中GM-CSF和IL-5協(xié)同參與調節(jié)EOS成熟、分化、活化、脫顆粒及凋亡等過程，在哮喘氣道炎癥的形成和維持中發(fā)揮重要作用[6]。

小青龍湯是《傷寒論》治療喘證的良方之一。全方由麻黃、桂枝、半夏、芍藥、干姜、細辛、五味子、炙甘草組成，具有解表散寒、溫肺化飲功效，目前臨床上廣泛用于治療過敏性哮喘、支氣管哮喘急性發(fā)作。本研究中，相較正常組，小青龍湯治療組可降低血清IgE含量和IL-5、GM-CSF基因的表達量。本實驗結果說明小青龍湯可通過降低IgE含量和IL-5、GM-CSF基因的過度表達，減少肺內EOS的浸潤，減輕IgE介導的氣道炎癥反應。

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