王 非 王 媛 趙 瑋 駱仙芳 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）是引起多臟器醫(yī)院感染的常見病原菌之一，能形成生物被膜，易在慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張等原有肺部慢性病變基礎(chǔ)上引起肺部反復(fù)感染并纖維化[1]。有證據(jù)顯示，銅綠假單胞菌生物被膜可能是引起該菌感染引起肺纖維的化主要因素[2-3]。然而，銅綠假單胞菌生物被膜如何誘導(dǎo)肺纖維化機(jī)制不明。我們采用銅綠假單胞菌生物被膜作用人肺上皮細(xì)胞，檢測其分泌炎癥細(xì)胞因子的情況，探討銅綠假單胞菌生物被膜在感染性纖維化中作用，以期為闡明銅綠假單胞菌生物被膜誘導(dǎo)的感染性肺纖維化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及培養(yǎng) 銅綠假單胞菌ATCC27853株購自北京中國藥品生物制品檢定所。將細(xì)菌接種于LB瓊脂平板上（Sigma），挑取單個菌落接種至 5mL LB培養(yǎng)液中，37℃、210r/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)12～16h。取lmL菌液10 000r/min離心 3min，取沉淀用0.01mol/L PBS（pH7.4）洗滌、離心2次。細(xì)菌沉淀用 lmL PBS重懸，經(jīng)麥?zhǔn)媳葷岱y定菌液濃度后用PBS配制成5×108CFU/mL菌液。

1.2. 細(xì)胞株及培養(yǎng) 人肺上皮細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。上述細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FCS，GiBco）、100 U/mL青霉素（Sigma）、100 U/mL鏈霉素（Sigma）的DMEM（GiBco）培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2～3 天傳代。

1.3 銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽的純化 銅綠假單胞菌ATCC27853株接種在LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)7天。刮取培養(yǎng)物懸于PBS中，17 000r/min，4℃離心30min，上清液用花板0.22μm濾膜過濾去除殘留菌體，100℃水浴30min使蛋白變性，17 000r/min，4℃離心30min，用80%的乙醇將其中的藻酸鹽沉淀。藻酸鹽粗提物溶解于含有10mM的MgCL2和1mM的CaCL2的PBS中，加入100μg/mL RNase A（Sigma）和100μg/mL Type IV DNase I （Sigma），37℃作用4h，水解其中的RNA和DNA，然后于80℃加熱30min，使酶變性。17 000r/min、25℃離心30min后，上清液再用80%的乙醇沉淀。沉淀物用0.025M的碳酸銨溶解后加到DEAE-TOYO-PEARAL 650S（Tosoh）層析柱上并用0.025M到1.0M的碳酸銨溶液洗脫，洗脫的組分（每試管5mL）用卡巴唑-硼酸法測定其中的藻酸鹽含量。收集藻酸鹽含量≥100μg/mL 試管中的洗脫液，PBS中透析48h，更換PBS 3次，得到的藻酸鹽再與AFFI-Preppolymyxin（Bio-Rad）混合攪拌24h，17 000r/min，25℃離心30 min，棄含脂多糖AFFIPreppolymyxin沉淀，取上清真空旋轉(zhuǎn)干燥。

1.4 炎性細(xì)胞因子檢測 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種1×104A549細(xì)胞，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12h使成單層細(xì)胞。參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別用懸浮于無抗生素2.5%FCS DMEM銅綠假單胞菌生物被膜 鹽（10 μg/mL）感染各細(xì)胞，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，3、6、12、24、48 h收集上清，用細(xì)胞因子ELISA定量檢測試劑盒（RapidBio Lab）檢測白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子（TNF-α）表達(dá)量。不同作用時間均重復(fù)3孔。實(shí)驗(yàn)中用非感染正常細(xì)胞作為對照（2.5%FCS DMEM）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，所得結(jié)果用（±s）表示。采用t檢驗(yàn)，方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽誘導(dǎo)A549細(xì)胞分泌IL-1β的作用 受銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽作用12h后，A549細(xì)胞分泌IL-1β水平開始增高，并在48h內(nèi)持續(xù)升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 藻酸鹽作用后A549細(xì)胞上清中IL-1β的濃度變化（± s） pg/mL

表1 藻酸鹽作用后A549細(xì)胞上清中IL-1β的濃度變化（± s） pg/mL

注：與空白對照組比較：△P＜0.05

組 別 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸鹽組(10μg/mL) 3 66.8±6.9 66.2±7.1 150.6±13.3△ 185.1±15.1△ 256.8±18.8△空白對照組（2.5%FCS DMEM） 3 67.1±7.6 67.4±6.3 68.8±7.2 71.0±8.1 70.4±7.6

2.2 銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽誘導(dǎo)A549細(xì)胞分泌IL-6的作用 受銅綠假單胞生物被膜藻酸鹽作用6h后，A549細(xì)胞分泌IL-6的表達(dá)量開始增高，至24h達(dá)到高峰，此后開始下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 藻酸鹽作用后A549細(xì)胞上清中IL-6的濃度變化（± s） pg/mL

表2 藻酸鹽作用后A549細(xì)胞上清中IL-6的濃度變化（± s） pg/mL

注：與空白對照組比較：△P＜0.05

組 別 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸鹽組(10μg/mL) 3 53.6±7.3 136.1±14.4△ 171.5±14.8△ 205.1±24.2△ 176.8±17.6△空白對照組（2.5%FCS DMEM） 3 56.2±8.6 57.4±9.2 54.8±8.2 61.0±8.1 60.4±8.6

2.3 銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽誘導(dǎo)A549細(xì)胞分泌IL-8的作用 受銅綠假單胞生物被膜藻酸鹽作用12h后，A54細(xì)胞分泌IL-8的量開始增高，24h達(dá)到高峰，此后有所下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 藻酸鹽作用后A549細(xì)胞上清中IL-8的濃度變化（± s） pg/mL

表3 藻酸鹽作用后A549細(xì)胞上清中IL-8的濃度變化（± s） pg/mL

注：與空白對照組比較：△P＜0.05

組 別 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸鹽組(10μg/mL) 3 92.1±11.7 96.2±10.7 195.0±19.0△ 210.8±16.6△ 124.2±15.0△空白對照組（2.5%FCS DMEM） 3 99.1±12.9 101.3±10.6 102.1±11.9 125.8±13.0 100.4±12.6

2.4 銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽誘導(dǎo)A549細(xì)胞分泌TNF-α的作用 受銅綠假單胞生物被膜藻酸鹽作用6h后，A549細(xì)胞分泌TNF-α的量開始增高，并在48 h內(nèi)持續(xù)升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 銅綠假單胞菌作用后A549細(xì)胞上清中TNF-α濃度變化（± s） pg/mL

表4 銅綠假單胞菌作用后A549細(xì)胞上清中TNF-α濃度變化（± s） pg/mL

注：與空白對照組比較：△P＜0.05

組 別 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸鹽組(10μg/mL) 3 29.5±3.9 67.5±5.9△ 100.1±7.6△ 155.3±13.6△ 233.2±13.5△空白對照組（2.5%FCS DMEM） 3 28.4±4.1 27.8±3.8 29.9±3.5 30.9±3.9 29.3±3.7

3 討論

一些病原微生物感染常可引起肺纖維化，感染引起的肺纖維化往往是肺部反復(fù)感染的結(jié)果，或病原微生物感染作為促進(jìn)因素導(dǎo)致其它原因引起的肺纖維化迅速發(fā)展。銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）是引起醫(yī)院感染的常見病原菌之一，80%～90%肺囊性纖維化病人肺組織標(biāo)本中檢出銅綠假單胞菌或其被膜菌[4]。迄今肺纖維化發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展，主要體現(xiàn)在肺纖維化相關(guān)細(xì)胞及其細(xì)胞因子領(lǐng)域，甚至有人提出了肺纖維化發(fā)病的肺組織細(xì)胞與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)學(xué)說[5]。其主要內(nèi)涵為：肺泡上皮細(xì)胞、肺間質(zhì)細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞是參與肺纖維化主要細(xì)胞，上述細(xì)胞均可分泌IL-1β、TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等，在肺纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[6-10]。

本研究參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[11-12]，體外誘導(dǎo)銅綠假單胞菌形成生物被膜，采用乙醇沉淀法提取細(xì)菌被膜并純化。選用人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549為靶細(xì)胞，分別檢測在銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽作用后上皮細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)情況，探討其在感染性纖維化中作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞在銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽作用后其分泌IL-1β和TNF-α水平48 h內(nèi)持續(xù)升高，但I(xiàn)L-6和IL-8則在作用后24 h達(dá)到高峰，之后有所下降。提示銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽均可促A549誘生上述4種炎性細(xì)胞因子的能力增強(qiáng)，但其誘導(dǎo)分泌的TNF-α、IL-1β水平則呈現(xiàn)為持續(xù)性增高，而IL-6、IL-8細(xì)胞因子水平升高呈一過性。本研究結(jié)果提示肺部反復(fù)感染銅綠假單胞菌形成生物被膜，可能首先作用于肺泡上皮細(xì)胞，靶細(xì)胞啟動相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，上調(diào)IL-1β、IL-6、IL-8 、TNF-α等炎性細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)肺泡炎癥，進(jìn)而誘導(dǎo)肺組織中成纖維細(xì)胞活化、增殖及轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)肺纖維化形成。

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