劉洪彥,楊?lèi)?ài)華,劉雪梅*,劉麗秋

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,山東青島 266003;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東青島 266003）

(Chin J Lab Diagn,2011,15:2014）

慢性腎功能衰竭(Chronic Renal Failure,CRF）是多種原發(fā)和繼發(fā)性腎臟病變持續(xù)進(jìn)展的共同結(jié)果,可出現(xiàn)多種并發(fā)癥,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命。腎間質(zhì)纖維化(Renal Interstitial Fibrosis,RIF）是各種腎臟疾病發(fā)展到CRF的共同途徑和主要基礎(chǔ)病理改變[1],如何延緩和阻斷RIF的進(jìn)展成為防治CRF的關(guān)鍵。研制一種重復(fù)性好、與臨床相似度高、穩(wěn)定的CRF動(dòng)物模型對(duì)于其進(jìn)展機(jī)制及并發(fā)癥的防治研究具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Yokozawa法[2]進(jìn)行改良,應(yīng)用腺嘌呤150對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃,以期構(gòu)建病變以RIF為主、由輕到重逐漸進(jìn)展且具備多種并發(fā)癥的CRF大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 材料與模型構(gòu)建方法

1.1.1 動(dòng)物與試劑 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠92只,體重230±20 g;腺嘌呤(Adenine）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組及方法 大鼠隨機(jī)分為模型1組(M1,n=28）、模型2組(M2,n=28）、對(duì)照1組(C1,n=18）和對(duì)照2組(C2,n=18）。M1以腺嘌呤150 mg/(kg?d）灌胃;M2以腺嘌呤300 mg/(kg?d）灌胃;C1和C2以等體積生理鹽水灌胃。M1、C1于實(shí)驗(yàn)第4、8、12周分別隨機(jī)抽取6只處死,M2、C2于實(shí)驗(yàn)第1、2、3周分別隨機(jī)抽取6只處死。所有大鼠每周檢測(cè)血壓。腎組織行HE、Masson染色,并進(jìn)行電鏡檢查。

1.2 觀察指標(biāo)①觀察大鼠一般情況。②檢測(cè)血紅蛋白(Hb）、血尿素氮(BUN）、血肌酐(Scr）、血鈣(Ca）、血磷(P）、血總膽固醇(TC）、尿蛋白/尿肌酐(UP/Ucr）。③光鏡下觀察腎臟病理改變,參照文獻(xiàn)[3]計(jì)算腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù):Masson染色下每張切片選取20個(gè)不重疊視野,將呈現(xiàn)為藍(lán)色的纖維化面積(去除腎小球和大血管）與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積的比值作為腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù),計(jì)算每個(gè)視野的纖維化指數(shù),求其平均值。④電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況兩組大鼠均出現(xiàn)少動(dòng)、精神萎靡、鼠毛稀疏、卷曲弓背及體重下降等表現(xiàn)。

2.2 死亡情況M1大鼠于第 75、79、81天各死亡1只,總死亡率為 10.71%;M2 大鼠于第 13、14、15、17、18、20天各死亡1只,第21天死亡2只,總死亡率為28.56%,第3周死亡率為42.86%。C1、C2無(wú)死亡。

2.3 血壓與對(duì)照組相比,M1大鼠于第6周時(shí)收縮壓輕度升高(P＞0.05）,第8周時(shí)明顯升高(P＜0.05）,并呈進(jìn)行性升高。M2血壓無(wú)明顯變化。

2.4 血液檢測(cè)①M(fèi)1、M2大鼠Scr、BUN 呈進(jìn)行性升高,各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比,皆有顯著差異(P＜0.01）。②M1大鼠Hb不斷下降,第8周和第12周與對(duì)照組相比,皆有顯著差異(P＜0.01）。M2大鼠Hb無(wú)明顯變化。③與相應(yīng)對(duì)照組相比,M1大鼠第4周時(shí)血磷升高(P＜0.05）,第8周時(shí)血鈣下降(P＜0.01）、TC升高 (P＜0.01）;第 12周時(shí)上述指標(biāo)變化進(jìn)一步增大。M2大鼠血磷、血鈣、TC無(wú)明顯變化。④對(duì)照組同一指標(biāo)不同時(shí)間點(diǎn)之間均無(wú)差異(P＞0.05）。

2.5 尿液檢測(cè)M1大鼠UP/Ucr進(jìn)行性升高,各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比,皆有顯著差異(P＜0.01）。M2大鼠于第2周時(shí)UP/Ucr較對(duì)照組升高(P＜0.05）,第3周UP/Ucr較第2周進(jìn)一步升高(P＜0.01）。對(duì)照組大鼠UP/Ucr未見(jiàn)明顯變化。

表1 第4、8、12周模型1組與對(duì)照1組各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s）

表1 第4、8、12周模型1組與對(duì)照1組各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s）

注:與相應(yīng)對(duì)照組相比,*P＜0.01,**P＜0.05;與第8周相比,▲P＜0.01,▲▲P＜0.05

項(xiàng)目 第4周 第8周 第12周模型1組 對(duì)照1組 模型1組 對(duì)照1組 模型1組 對(duì)照1組例數(shù) 6 6 6 6 6 6肌酐(μ mol/L） 159.00±9.84*▲ 65.19±4.60 221.00±15.75* 69.33±11.43 276.18±22.99*▲ 66.84±7.68尿素氮(mmol/L） 27.67±3.59*▲ 7.06±0.74 42.39±4.90* 7.23±0.66 62.97±6.76*▲ 7.34±1.18血鈣(mmol/L） 2.50±0.11▲ 2.54±0.07 2.39±0.63* 2.52±0.06 1.99±0.74*▲ 2.50±0.10血磷(mmol/L） 2.79±0.47**▲ 2.28±0.14 4.72±0.63* 2.27±0.10 6.67±0.87*▲ 2.25±0.11總膽固醇(mmol/L） 1.65±0.12▲▲ 1.64±0.06 1.91±0.12* 1.64±0.05 2.37±0.28*▲ 1.67±0.04血紅蛋白(g/L） 147.67±3.61▲ 151.44±5.89 127.33±4.68* 149.50±5.13 98.00±6.84*▲ 148.67±4.63尿蛋白/尿肌酐 0.72±0.10*▲ 0.38±0.07 1.04±0.10* 0.36±0.06 1.77±0.12*▲ 0.40±0.07收縮壓(mmHg） 115.17±4.07▲▲ 113.50±7.23 124.33±7.12** 112.33±6.35 136.17±5.98*▲ 114.33±4.63纖維化指數(shù)(%） 16.15±7.61*▲ 4.7±2.13 36.70±10.97* 4.90±1.48 70.40±13.55*▲ 4.6±2.24死亡數(shù)/總數(shù) 0/28 0/18 0/22 0/12 3/16 0/6

表2 第1、2、3周模型2組與對(duì)照2組各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s）

表2 第1、2、3周模型2組與對(duì)照2組各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s）

注:與相應(yīng)對(duì)照組相比,*P＜0.01,**P＜0.05;與第2周相比,▲P＜0.01,▲▲P＜0.05

項(xiàng)目 第1周 第2周 第3周模型1組 對(duì)照1組 模型1組 對(duì)照1組 模型1組 對(duì)照1組例數(shù) 6 6 6 6 6 6肌酐(μ mol/L） 168.67±11.08*▲ 66.12±6.21 203.50±11.26* 63.68±7.88 234.83±14.13*▲ 64.22±7.37尿素氮(mmol/L） 29.21±3.70*▲ 6.94±0.70 37.02±5.37* 7.32±0.95 53.33±9.43*▲ 7.30±1.06血鈣(mmol/L） 2.49±0.12 2.51±0.11 2.48±0.08 2.47±0.08 2.49±0.08 2.51±0.09血磷(mmol/L） 2.24±0.05 2.27±0.05 2.27±0.09 2.25±0.06 2.36±0.09**▲▲ 2.28±0.09總膽固醇(mmol/L） 1.65±0.09 1.64±0.06 1.65±0.06 1.67±0.06 1.67±0.07 1.64±0.06血紅蛋白(g/L） 146.17±5.71 148.50±4.89 147.67±6.25 149.17±5.71 147.50±7.92 150.67±8.09尿蛋白/尿肌酐 0.40±0.08▲▲ 0.38±0.05 0.48±0.07** 0.37±0.06 0.71±0.09*▲ 0.39±0.08收縮壓(mmHg） 113.33±5.88 116.00±6.03 112.17±5.56 114.67±5.53 112.83±5.13 115.50±5.39纖維化指數(shù)(%） 5.45±1.96▲ 4.5±1.93 8.60±3.39* 4.8±1.64 19.15±7.17*▲ 4.65±1.76死亡數(shù)/總數(shù) 0/28 0/18 2/22 0/12 6/14 0/6

2.6 腎臟組織病理變化

2.6.1 肉眼 模型組大鼠腎臟體積明顯增大,呈灰白色,初期可見(jiàn)彌漫的小米粒大小的白色顆粒,后期表面凹凸不平。

2.6.2 光鏡 ①M(fèi)1:第4周,腎小管管腔及間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯針狀褐色2,8-二羥基腺嘌呤結(jié)晶(見(jiàn)圖1A）,腎小管廣泛擴(kuò)張,部分萎縮消失,管腔內(nèi)可見(jiàn)管型。腎間質(zhì)內(nèi)有膠原纖維增生及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1B）。腎小球可見(jiàn)輕度系膜增生。第8周,腎小管大量萎縮消失,間質(zhì)增寬,纖維組織較第4周明顯增多。腎小球出現(xiàn)囊壁增厚、系膜輕中度增生、細(xì)胞增多。第12周,上述病理改變進(jìn)一步加重,腎間質(zhì)重度纖維化(見(jiàn)圖1D）,腎小球出現(xiàn)毛細(xì)血管袢閉塞、纖維化硬化、數(shù)目減少。對(duì)照組大鼠腎臟未見(jiàn)明顯異常(見(jiàn)圖1C、1F）。②M2:第1周,腎小管內(nèi)可見(jiàn)結(jié)晶沉積,腎間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),未見(jiàn)明顯纖維增生;第2周,腎間質(zhì)輕度纖維增生;第3周部分腎小管萎縮、消失,腎間質(zhì)纖維化較明顯,腎小球輕度系膜增生、細(xì)胞增多(見(jiàn)圖1E）。

圖1 各組大鼠腎臟病理變化(×400）

2.6.3 電鏡 M1大鼠于實(shí)驗(yàn)第4周時(shí),近曲小管管腔內(nèi)可見(jiàn)菱形針狀結(jié)晶(見(jiàn)圖2A）。隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng),結(jié)晶明顯增多,近曲腎小管基底膜增厚、斷裂,腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)溶酶體增多、線粒體腫脹、結(jié)晶沉積及明顯的膠原纖維(見(jiàn)圖2B）。腎間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞增多及明顯纖維增生。M2也可見(jiàn)結(jié)晶沉積,第3周時(shí)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量膠原纖維。對(duì)照組大鼠腎臟未見(jiàn)明顯異常。

3 討論

圖2 模型組大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)

理想的動(dòng)物模型應(yīng)具備良好的臨床相似性,相似度越高,越有利于人類(lèi)疾病的研究。綜合文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)[4,5],近年來(lái)眾多學(xué)者應(yīng)用腺嘌呤300mg/(kg?d）灌胃3周左右制備的CRF動(dòng)物模型,均出現(xiàn)腎功異常,但并無(wú)貧血、高血壓等并發(fā)癥。此模型以腎間質(zhì)纖維化為主要病變,但鮮有學(xué)者動(dòng)態(tài)觀察其病理變化。因此,有必要對(duì)此模型進(jìn)一步研究并改良,以制備更加符合CRF臨床表現(xiàn)及發(fā)展特點(diǎn)的動(dòng)物模型。為此,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腺嘌呤150 mg/(kg?d）灌胃12周與上述方法進(jìn)行比較,并動(dòng)態(tài)觀察模型變化。

應(yīng)用腺嘌呤150 mg/(kg?d）對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃,結(jié)果顯示第4周時(shí)大鼠腎功能異常并進(jìn)行性加重;第8周時(shí)具有輕度貧血、高血壓、脂代謝及鈣磷代謝紊亂;隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng),病情不斷進(jìn)展,第12周時(shí)腎功能?chē)?yán)重受損,并發(fā)癥表現(xiàn)突出;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠停止腺嘌呤灌胃并繼續(xù)飼養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎功能較停止灌胃前下降,提示腎臟病變已進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的慢性進(jìn)展過(guò)程。以上模型變化與CRF的臨床表現(xiàn)和病程發(fā)展特點(diǎn)極為相似。通過(guò)光鏡和電鏡觀察,第4周時(shí)大鼠腎臟可見(jiàn)間質(zhì)纖維化,隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行其纖維化程度進(jìn)行性加重,而腎小球病變程度相對(duì)較輕。由此可見(jiàn),應(yīng)用腺嘌呤150 mg/(kg?d）對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃可以成功構(gòu)建以RIF病變?yōu)橹髑也∽冇奢p到重不斷進(jìn)展的大鼠CRF模型。有研究報(bào)道[6,7],腺嘌呤代謝生產(chǎn)2,8-二羥基腺嘌呤,后者沉積在腎小管,影響氮質(zhì)化合物的排泄,最終引起腎功能衰竭。電鏡下可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)有結(jié)晶沉積和大量膠原纖維(與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]）,提示腎小管上皮細(xì)胞可吸收結(jié)晶并可能發(fā)生腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[9,10],參與腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

以腺嘌呤300 mg/(kg?d）對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃,第1周與第2周時(shí)大鼠腎功能急劇惡化,病理檢查可見(jiàn)腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞腫脹、間質(zhì)內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),未見(jiàn)腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化等慢性腎衰表現(xiàn),此情況符合急性腎損害的特點(diǎn);第3周時(shí)可見(jiàn)腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化,但未出現(xiàn)CRF常有的并發(fā)癥。由此提示,該模型與CRF患者的臨床表現(xiàn)(病變緩慢進(jìn)展、伴發(fā)多個(gè)系統(tǒng)并發(fā)癥）相似性較差,難以滿足CRF進(jìn)展機(jī)制及其并發(fā)癥防治研究的需要,可用于慢性腎衰的早期研究及藥物療效的探討。另外,該方法死亡率高,不利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

綜合分析認(rèn)為,腺嘌呤 150 mg/(kg?d）灌胃12周的腎衰模型成功模擬了人類(lèi)CRF發(fā)生、發(fā)展的病程和特點(diǎn),其優(yōu)點(diǎn)在于制作方便、穩(wěn)定性好、死亡率低、具備多種CRF并發(fā)癥,臨床相似度高,能較好地滿足CRF進(jìn)展機(jī)制及其并發(fā)癥防治研究的需要。

[1]Hewitson TD.Renal tubulointerstitial fibrosis:common but never simple[J].Am J Physiol Renal Physilo,2009,296(6）:1239.

[2]Yokozawa T,Ping dong zheng,Hikokichi O,et al.Animal model of adenine-induced chronic renal failure in rats[J].Nepohron,1986,44:230.

[3]Moriy Ama T,Kawada N,Nagatoya K,et al.Fluvastatin suppresses oxidative stress and fibrosis in the interstitum mouse kidney with unilateral ureteral obstruction[J].Kidney Int,2001,59(6）:2095.

[4]張 穎,侯兆輝.慢性腎功能衰竭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究[J].吉林中醫(yī)藥,2008,28(11）:839.

[5]苗緒紅,蘇冠男,饒冠華等.大丁草(Gerbera anandria(L.）Sch Bip.）對(duì)腺嘌誘導(dǎo)的慢性腎功能衰竭大鼠TGF-β和ET-1mRNA表達(dá)的影響[J].南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,42(1）:101.

[6]Ali BH,Al-Salam S,Al Husseni I,et al.Effects of Gum Arabic in rats with adenine-induced chronic renal failure[J].Exp Biol Med(Maywood）,2010,235(3）:373.

[7]楚 非,鄒萬(wàn)忠,孫鎖柱等.大鼠腎小管間質(zhì)纖維化中腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的研究[J].中華腎臟病雜志,2003,19(1）:10.

[8]Faculte H,Lacour B,Daudon M.2,8-dihydroxyadenine nephrolithiasis:from diagnosis to therapy[J].Ann Biol Clin,2007,65(6）:585.

[9]Dong-ha Shin,Hyun-Min Park,Kyeong-Ah Jung,et al.The NRF2-heme oxygenase-1 system modulates cyclosporine A-induced epithelial-mesenchymal transition and renal fibrosis[J].Free Radical Biology and Medicine,2010,48:1051.

[10]He CM,Zheng FL,Liu YP.The effects of mycophenolate mofetil on renal interstitial fibrosis and epithelial-myofibroblast translation in adenine-induced renal failure rats[J].Zhonghua Nei Ke Za Zhi,2008,47(11）:901.