王一棟，楊瀟，單可記，代冬梅，許汪斌

（1.溫州市第二人民醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325000；2.昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 ICU科，云南 昆明 650032）

2009年甲型H1N1流感病毒代替季節(jié)性H1N1流感病毒，成為此次流感大流行的病因，它起源于豬流感病毒。由于病毒的抗原轉(zhuǎn)變，人類缺乏抗體，它的病死率高于季節(jié)性流感，而明顯低于H5N1流感[1]。病理性肥胖、心血管疾病、妊娠和免疫力功能低下的患者為此次甲型H1N1流感危重癥的高危人群[2-3]。

2009年甲型H1N1流感病毒感染后，患者可出現(xiàn)發(fā)熱、鼻塞、流涕、咽痛、咳嗽、肌痛、乏力和全身不適等流感樣癥狀。相對(duì)于季節(jié)性流感病毒，新流感病毒更易侵犯哺乳動(dòng)物的下呼吸道。部分患者病情進(jìn)展迅速，可出現(xiàn)細(xì)胞免疫功能低下和出血性壞死性肺炎，嚴(yán)重者可導(dǎo)致多器官功能衰竭，甚至死亡。在H5N1流感病毒的患者研究中，死亡的H5N1流感患者有著高病毒載量和高細(xì)胞因子血癥[4]。但對(duì)于2009年甲型H1N1流感病毒，目前我國(guó)鮮見(jiàn)相關(guān)的細(xì)胞因子的報(bào)道。我們參考以往對(duì)H5N1流感患者的細(xì)胞因子的研究，選擇致炎因子白介素-2（IL-2）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及抑炎因子IL-4、IL-10作為我們研究的細(xì)胞因子。

昆明醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院ICU科成為云南省收治重癥2009年甲型H1N1流感患者的指定地點(diǎn)，我們有機(jī)會(huì)對(duì)2009年甲型H1N1流感患者的細(xì)胞因子進(jìn)行前瞻性的研究。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 納入本次研究的20例甲型 H1N1流感患者均為發(fā)病后3 d內(nèi)入院，既往均體健，沒(méi)有已知的基礎(chǔ)疾病，平均年齡為（34.65±15.66）歲（16～71歲）。男9例，女11例，年齡＞65歲2名，孕婦3名。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部頒發(fā)的《甲型H1N1流感診斷治療方案（2009試行版第三版）》[5]及衛(wèi)生部制定的《甲型H1N1流感出院標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2 研究方法 本研究是以入院時(shí)以氧合指數(shù)200為界，將甲型H1N1患者分為A組（n=10例）和B組（n=10例）。A組平均氧合指數(shù)為321.27±131.60，B組平均氧合指數(shù)為152.27±54.04。兩組均給予抗病毒（奧司他韋及利巴韋林抗病毒）、抗細(xì)菌感染、呼吸支持（包括無(wú)創(chuàng)及有創(chuàng)呼吸支持）及小劑量的激素治療（甲強(qiáng)龍40 mg，每12 h 1次）。分別于入院時(shí)、治療第1、3、5天抽取外周靜脈血4 mL檢測(cè)細(xì)胞因子。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病原學(xué)檢測(cè)

1.3.1.1 檢測(cè)方法：甲型H1N1流感疑似病例入院后，采集上呼吸道標(biāo)本。咽拭子采集后送交疾病控制中心（CDC）進(jìn)行real-time RT-PCR病毒核酸檢測(cè)。

1.3.1.2 咽拭子采樣器材：拭子：使用頭部為聚酯纖維的拭子。采集管：外螺旋口，耐-70 ℃凍存。采樣液：含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、阻止細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的抗生素和緩沖液。

1.3.1.3 甲型H1N1實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)：甲型流感病毒通用（M基因）陽(yáng)性，豬H1N1流感病毒通用（NP基因）陽(yáng)性，甲型H1N1流感病毒特異（HA基因）陽(yáng)性的標(biāo)本，3項(xiàng)均為陽(yáng)性可確診為感染甲型H1N1病毒。

1.3.2 細(xì)胞因子的檢測(cè)

1.3.2.1 白介素的檢測(cè)：主要試劑：預(yù)包被微孔反應(yīng)板，濃縮酶結(jié)合物，酶結(jié)合物稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液，生物素化的抗人白介素抗體，白介素標(biāo)準(zhǔn)品，濃縮洗滌液，顯色劑A、B，終止液。儀器：酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。檢測(cè)步驟：在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測(cè)樣本、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品10OμL，再加生物素化的抗人白介素抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素5Ord；振蕩混勻，置20～25 ℃環(huán)境中溫育120 min；將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥；除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液100μL；振蕩混勻，置20～25 ℃環(huán)境中溫育3O min；將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥；每孔加入顯色劑A、B各50μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃環(huán)境中避光顯色10 min；加入終止液5OμL后，輕輕振蕩混勻；用酶標(biāo)儀（45O nm波長(zhǎng)）測(cè)定各孔吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，求出白介素水平。

1.3.2.2 TNF-α的檢測(cè)：主要試劑：預(yù)包被微孔反應(yīng)板，濃縮酶結(jié)合物，酶結(jié)合物稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液，生物素化的抗人TNF抗體，TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品，濃縮洗滌液，顯色劑A、B，終止液。儀器：酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。檢測(cè)步驟：在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測(cè)樣本、標(biāo)準(zhǔn)品5μL，輕輕混勻10 s。每孔加入20OμL抗人TNF-α抗體，輕輕混勻30 s，置37 ℃環(huán)境中溫育30 min。將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液200μL，輕輕混勻10 s，置37 ℃環(huán)境中溫育30 min。將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。每孔加入TMB顯色劑各1OOμL，輕輕振蕩混勻10 s，37 ℃環(huán)境中避光顯色20 min。加入終止液100μL后，輕輕振蕩混勻30 s。用酶標(biāo)儀（45O nm波長(zhǎng)）測(cè)定各孔吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，求出TNF-α水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示。組內(nèi)比較采用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-2水平 總體均數(shù)明顯呈下降趨勢(shì)，由（12.87±12.76）pg/mL下降至（1.15±0.68）pg/mL。與氧合指數(shù)≥200組相比，入院時(shí)及治療第1天氧合指數(shù)＜200組IL-2升高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 氧合指數(shù)≥200組與氧合指數(shù)＜200組IL-2比較（n=10±s）

表1 氧合指數(shù)≥200組與氧合指數(shù)＜200組IL-2比較（n=10±s）

與氧合指數(shù)≥200組比：*P＜0.05

入院 治療第1天 治療第3天 治療第5天全部患者 12.87±12.76 5.03±4.97 1.31±0.57 1.15±0.68氧合指數(shù)＜200 20.44±15.99* 8.28±7.92* 1.59±0.38 1.04±0.64氧合指數(shù)≥200 5.29±3.56 1.77±0.42 1.03±0.61 1.25±0.74

2.2 IL-4水平 與氧合指數(shù)≥200組相比，治療第3天氧合指數(shù)＜200組IL-4明顯增高（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 氧合指數(shù)≥200組與氧合指數(shù)＜200組IL-4比較（n=1±s）

表2 氧合指數(shù)≥200組與氧合指數(shù)＜200組IL-4比較（n=1±s）

與氧合指數(shù)≥200組比：**P＜0.01

入院 治療第1天 治療第3天 治療第5天全部患者 1.42±0.60 1.04±0.61 5.43±5.12 1.14±0.38氧合指數(shù)＜200 1.59±0.38 1.04±0.64 8.82±7.92** 1.23±0.36氧合指數(shù)≥200 1.25±0.74 1.03±0.61 2.57±1.32 1.04±0.39

2.3 IL-6水平 總體均數(shù)明顯呈下降趨勢(shì)，由（27.26±27.88）pg/mL下降至（1.15±0.51）pg/mL。與氧合指數(shù)≥200組相比，入院及治療第1天氧合指數(shù)＜200組IL-6明顯增高（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 氧合指數(shù)≥200組與氧合指數(shù)＜200組IL-6比較（n=10±s）

表3 氧合指數(shù)≥200組與氧合指數(shù)＜200組IL-6比較（n=10±s）

與氧合指數(shù)≥200組比：**P＜0.01

入院 治療第1天 治療第3天 治療第5天全部患者 27.26±27.88 6.43±6.93 1.25±0.65 1.15±0.51氧合指數(shù)＜200 49.56±23.06** 10.28±8.16** 1.47±0.64 1.25±0.61氧合指數(shù)≥200 4.96±1.92 2.57±1.33 1.03±0.61 1.04±0.39

2.4 IL-10水平 與氧合指數(shù)≥200組相比，入院及治療第3天氧合指數(shù)＜200組IL-10明顯增高（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 氧合指數(shù)≥200組與氧合指數(shù)＜200組IL-10比較（n=10±s）

表4 氧合指數(shù)≥200組與氧合指數(shù)＜200組IL-10比較（n=10±s）

與氧合指數(shù)≥200組比：*P＜0.05，**P＜0.01

入院 治療第1天 治療第3天 治療第5天全部患者 5.43±6.26 6.51±4.38 3.86±3.09 2.15±1.06氧合指數(shù)＜200 8.28±7.92** 7.45±5.67 4.93±3.98* 2.21±0.65氧合指數(shù)≥200 2.57±1.33 2.56±1.32 2.78±1.30 2.09±1.40

2.5 TNF-α水平 總體均數(shù)明顯呈下降趨勢(shì)，由（37.56±48.48）pg/mL下降至（6.25±9.29）pg/mL。與氧合指數(shù)≥200組比，氧合指數(shù)＜200組TNF-α明顯增高（P＜0.01）。見(jiàn)表5。

表5 氧合指數(shù)≥200組與氧合指數(shù)＜200組TNF-α比較（n=10±s）

表5 氧合指數(shù)≥200組與氧合指數(shù)＜200組TNF-α比較（n=10±s）

與氧合指數(shù)≥200組比：**P＜0.01

入院 治療第1天 治療第3天 治療第5天全部患者 37.56±48.48 18.31±26.32 11.09±18.51 6.25±9.29氧合指數(shù)＜200 70.16±50.96** 32.62±31.85** 19.37±23.87** 9.95±12.23**氧合指數(shù)≥200 7.40±5.52 4.96±1.92 3.99±2.24 2.80±5.75

3 討論

20世紀(jì)全球共發(fā)生5次流感大流行，自有記載以來(lái)最大的一次流感是1918-1919年發(fā)生在西班牙的甲型H1N1流感，導(dǎo)致全球4000～10000萬(wàn)人死亡，死亡人數(shù)超過(guò)兩次世界大戰(zhàn)死亡人數(shù)的總和[6-7]。流感病毒由于抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變，極易發(fā)生變異，使得人群對(duì)新出現(xiàn)的病毒株缺乏免疫力，導(dǎo)致流感的周期性爆發(fā)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，新流感病毒在病毒復(fù)制和誘發(fā)細(xì)胞因子的作用類似于季節(jié)性流感病毒，但明顯弱于H5N1流感病毒[1]。但是，新甲流病毒易同時(shí)侵犯上呼吸道和下呼吸道，不像季節(jié)性流感病毒主要侵犯上呼吸道[8-9]。在死亡的患者中，彌漫性的肺泡損傷、反應(yīng)性嗜紅細(xì)胞現(xiàn)象和淋巴結(jié)萎縮類似于H5N1感染所致的患者[10]。由于流感病毒主要侵犯呼吸道，所以我們根據(jù)氧合指數(shù)，分為重癥組和非重癥組，即A組和B組，研究其細(xì)胞因子的變化趨勢(shì)。

機(jī)體的病毒載量在流感癥狀發(fā)生的2～3d達(dá)到高峰，隨著機(jī)體免疫功能的激活，病毒復(fù)制到達(dá)一個(gè)平臺(tái)期[11]。奧司他韋等抗病毒治療能快速地抑制病毒的復(fù)制，而免疫球蛋白和含有中和抗體的血漿也被認(rèn)為是重癥流感患者的有效治療手段，它們都可以減輕過(guò)度的炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞因子雖然有抗病毒的作用，但是也會(huì)造成組織損傷，在重癥的流感患者中，機(jī)體有著更高的細(xì)胞因子水平。在感染流感病毒的獼猴模型中，肺泡液中IL-6和MCP-1的升高程度與疾病的嚴(yán)重性有關(guān)[9]。IL-10在減輕嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)是必需的，在流感病毒感染的小鼠模型中，IL-10的缺乏具有保護(hù)現(xiàn)象，而高的IL-10水平具有不良的抗體反應(yīng)[12-13]。我們研究的20例確診的新流感患者中，IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的升高與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，重癥患者的細(xì)胞因子水平高于非重癥患者。IL-2、IL-6和TNF-α作為致炎因子，在重癥患者的血中濃度一直高于非重癥。IL-4和IL-10作為抑炎因子，在入院后第1天和第3天升高后又下降，可能與病情的好轉(zhuǎn)，炎癥反應(yīng)的減輕有關(guān)。總體上，隨著病情的好轉(zhuǎn)，細(xì)胞因子的水平逐漸下降。

總之，重癥流感患者有著更高的細(xì)胞因子水平，流感病毒引起機(jī)體的炎癥風(fēng)暴是這次流感大流行期間重癥患者的重要致病機(jī)制。在臨床工作中，快速有效的抗病毒治療可以減輕機(jī)體的病毒復(fù)制，免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用可以減輕患者的炎癥風(fēng)暴，減少機(jī)體組織的損害，可能有助于重癥患者的恢復(fù)。

[1] Li IW, Chan KH, To KW, et al. Differential susceptibility of different cell lines to swine-origin influenza A H1N1,seasonal human influenza A H5N1 viruses[J]. J Clin Virol,2009,46(4):325-330.

[2] Hanshaoworakul W, Simmerman JM, Narueponjirakul U,et al. Severe human influenza infections in Thailand:oseltamivir treatment and risk factors for fatal outcome[J].Plos One, 2009, 4(6):e6051.

[3] Jamieson DJ, Honein MA, Rasmussen SA, et al. Novel Infuenza A(H1N1) Pregnancy Working Group. H1N1 2009 infuenza virus infection during pregnancy in the USA[J].Lancet,2009,374(9688):451-458.

[4] de Jong MD, Simmons CP, Thanh TT, et al. Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia[J]. Nat Med, 2006, 12(10):1203-1207.

[5] 衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于印發(fā)《甲型H1N1流感診療方案(2009年試行版第三版)》的通知[EB/OL].http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohyzs/s3586/200910/43111.htm

[6] Johnson NP, Mueller J. Updating the accounts:global mortality of the 1918--1920 "Spanish" influenza pandemic[J].Bull Hist Med,2002,76(1):105-115.

[7] Oxford JS. Influenza A pandemics of 20th century with special reference to 1918:virology,pathology and epidemiology[J]. Rev Mec Virol,2000,10(2):119-133.

[8] Munster VJ, de Wit E, van den Brand JM, et al. Pathogenesis and transmission of swine-origin 2009 A (H1N1) influenza virus in ferrets[J]. Science,2009,325(5939):481-483.

[9] Itoh Y, Shinya K, Kiso M, et al. In vitro and in vivo characterization of new swine-origin H1N1 influenza viruses[J].Nature,2009,460(7258):1021-1025.

[10] Yuen KY, Chan PK, Peiris M, et al. Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus[J]. Lancet,1998,351(9101):467-471.

[11] Moltedo B, Lopez CB, Pazos M, et al. Cutting edge: stealth influenza virus replication precedes the initiation of adaptive immunity[J]. J Immunol,2009,183(6):3569-3573.

[12] McKinstry KK, Strutt TM, Buck A, et al. IL-10 deficiency unleashes an influenza -specific Th17 response and enhances survival against high-dose challenge[J]. J Immunol,2009,182(12):7353-7363.

[13] Corsini E, Vismara L, Lucchi L,et al. High interleukin-10 production is associated with low antibody response to influenza vaccination in the elderly[J]. J Lerkoc Biol,2006,80(2):376-382.