施通，吳輝，高元興，岳軍，劉付麗，徐旭仲

（溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325000）

姜黃素（curcumin）是從姜科姜黃屬植物姜黃（curcuma longa L）根莖中提取的一種酚類天然色素。在傳統(tǒng)的印第安醫(yī)學中它被用以治療各種各樣的疾病，包括風濕病、軀體疾病、皮膚病、消化功能紊亂、間歇性發(fā)熱、白斑病和閉經(jīng)等[1-2]。最近幾年，大量研究數(shù)據(jù)闡明了姜黃素非在體條件下的潛在藥理學作用，包括抗微生物、抗病毒、抗真菌、抗感染和抗腫瘤等作用。但其對心臟的作用研究報道較少，目前鮮見其對心肌細胞離子通道產(chǎn)生影響的研究。本研究采用全細胞膜片鉗記錄技術，觀察姜黃素對急性分離的大鼠心室肌細胞鈉通道和鈣通道電流的影響，闡明姜黃素對心肌細胞離子通道的作用機制，為姜黃素的藥理開發(fā)和安全使用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 成年清潔級SD大鼠250～300 g，由溫州醫(yī)學院動物中心提供。I型膠原酶（collagenaseI），XIV型蛋白酶（protease XIV），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），姜黃素（curcumin），二甲基亞砜（DMSO），N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES）、乙二醇-雙四乙酸（EGTA）、氯化銫（CsCl）、谷氨酸（L-Glutamic acid）、牛磺酸（taurine）、CaCl2、Na2ATP、MgATP、CsOH為Sigma公司產(chǎn)品。氯化四乙胺（TEA-Cl）為Lancaster公司產(chǎn)品。其余化學試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 溶液配制 分離心室肌細胞和記錄離子通道電流所使用的溶液配制如下（單位為mmol/L）：①臺氏液：NaCl 137、KCl 5.4、CaCl21.8、MgCl21.0、NaH2PO40.33、HEPES 10、Glucose 10，用NaOH調(diào)pH至7.35。臺氏液中去除CaCl2即為無鈣臺氏液。②KB液：KCl 40、KH2PO420、MgSO43.0、KOH 80、谷氨酸50、牛磺酸20、HEPES 10、Glucose 10、EGTA 0.5，用KOH調(diào)pH至7.35。③ICa-L細胞外液：Choline-Cl 140、MgCl21.0、CaCl22.0、HEPES 5、Glucose 10、CsCl 4.6、TEA-Cl 10，CsOH調(diào)pH至7.4。④ICa-L電極內(nèi)液：CsCl 120、MgCl21.0、MgATP 5.0、EGTA 10、HEPES 10，CsOH調(diào)pH至7.3。⑤INa細胞外液：Choline-Cl 140、NaCl 20、MgCl21.0、HEPES 5、Glucose 10、CsCl 4.6，CsOH調(diào)pH至7.4。⑥INa電極內(nèi)液：CsCl 120、NaCl 10、MgCl21.0、Na2ATP 5.0、EGTA 10、HEPES 10，CsOH調(diào)pH至7.3。⑧50μmol/L姜黃素灌流液：用DMSO配制10 mmol/L姜黃素溶液，然后分別用不同通道外液將其稀釋至50μmol/L備用。所有液體均用雙蒸水（RIOS5+，MILLIPORE 美國）配制。

1.3 SD大鼠心室肌細胞分離 SD大鼠腹腔注射5%水合氯醛7 mL/kg，約5 min后，用血管鉗夾大鼠肢端，無反射后可開胸取心臟。在4 ℃臺氏液中去除脂肪和心包膜，分離主動脈并插管，行Langendoff心臟灌流。先用無鈣臺氏液灌流4 min（灌注壓約為6 kPa），以去除冠脈內(nèi)血液并使心臟停跳。再用含1 mg/mLI型膠原酶、0.05 mg/mL XIV型蛋白酶和50μmol/L CaCl2的無鈣臺氏液30 mL循環(huán)灌流約6～10 min。整個灌流系統(tǒng)溫度保持在35～37 ℃，使流出心臟的液體溫度在34 ℃左右，流速10～12 mL/min[3]。所有灌流液和KB液均通以100% O2飽和15 min以上。然后將心臟從Langendorff裝置上取下，剪下心室部分，放入含10 mg/mL BSA的KB液中，用小剪刀將其剪碎至約1 mm3，再用玻璃滴管充分吹打2～3 min，用100目微孔尼龍膜過濾后，留取濾液室溫下穩(wěn)定1 h后備用。

1.4 全細胞膜片鉗記錄 實驗前吸取少許富含細胞的KB懸液于0.5 mL的灌流槽中，靜置5～10 min，待細胞沉底附壁后，用100% O2飽和的細胞外液進行表面灌流5～10 min，流速2～3 mL/min。在倒置顯微鏡（TE2000-U，Nikon，日本）下選擇邊緣清楚，表面光滑，橫紋清晰，無收縮的細胞。采用Hamill等[4]首創(chuàng)的全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制模式下記錄各種通道電流。膜片鉗放大器（EPC10，HEKA，德國）通過A/D和D/A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器同計算機相連接。刺激信號及電壓、電流輸入信號的采集均由軟件pulse 8.0控制。玻璃毛胚經(jīng)微電極拉制儀（P-97，SUTTER，美國）拉制而成，尖端直徑1～1.5μm。充灌電極內(nèi)液后入水電阻為1.0～2.5 MΩ，調(diào)節(jié)三維操縱器（MP-285，SUTTER，美國）使電極尖端移向細胞表面，形成高阻封接(Giga seal)，封接電阻1 GΩ以上，補償快電容并吸破細胞膜，補償慢電容形成全細胞記錄模式。

1.5 通道電流的刺激參數(shù)設置 記錄INa時細胞外液和電極內(nèi)液中以CsCl代替KCl以消除鉀電流對INa的影響。為了降低INa的電流強度以減少鉗位誤差，采取室溫下記錄，并降低細胞外液的NaCl濃度至20 mmol/L，其余的NaCl成分用Choline-Cl代替以維持滲透壓平衡。記錄INa的I-V曲線刺激方案為Vh-90 mV，Vs從-90 mV開始，以10 mV階躍刺激至+50 mV，波寬50 ms，刺激頻率0.2 Hz。

記錄ICa-L時細胞外液和電極內(nèi)液中以CsCl代替KCl，并加入TEA-Cl以阻斷鉀電流，細胞外液以Choline-Cl代替NaCl，并設保持電位為-40 mV以去除INa和T-型鈣電流（ICa-T）。記錄ICa-L電流-電壓（I-V）曲線的刺激方案為保持電位（Vh）-40 mV，步階鉗制電壓（Vs）從-40 mV開始，以10 mV階躍刺激至50 mV，時程250 ms，刺激頻率0.2 Hz。

1.6 姜黃素灌流和數(shù)據(jù)采集 每個通道電流記錄時細胞灌流藥物前采集對照I-V曲線，然后用微灌流系統(tǒng)（DADVC-8PP，ALA SCIENTIFIC，美國），灌流50μmol/L姜黃素5 min，記錄灌藥后的I-V曲線。原始電流數(shù)據(jù)采用pulsefit進行分析和測量，使用Origin6.1對測量后的數(shù)據(jù)進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對大鼠心室肌細胞INa和ICa-L的影響

2.1.1 INa：以測試電壓-30 mV，5個大鼠心室肌細胞的INa峰值電流密度作為觀察指標，得出50μmol/L姜黃素對INa的抑制率為71.9%±6.3%（見表1）。50 μmol/L姜黃素對INa影響的原始電流圖見圖1。

表1 姜黃素（50μmol/L）對大鼠心室肌細胞INa和ICa-L的影響（±s）

表1 姜黃素（50μmol/L）對大鼠心室肌細胞INa和ICa-L的影響（±s）

離子通道 細胞數(shù)INa ICa-L 55給藥前(PA/PF)-17.0±3. 8-6.4±0.8給藥后(PA/PF)-4.7±1.0-6.5±1.4抑制率(%)71.9±6.3**-1.7±13.1

圖1 A為大鼠心室肌細胞INa電流曲線，B為灌流50μmol/L姜黃素5 min后INa的電流曲線

2.1.2 ICa-L：以測試電壓10 mV，5個大鼠心室肌細胞的ICa-L峰值電流密度作觀察指標，得出50μmol/L姜黃素對ICa-L的抑制率為-1.7%±13.1%。圖2為50 μmol/L姜黃素對ICa-L影響的原始電流圖。

圖2 A為大鼠心室肌細胞ICa-L電流曲線，B為灌流50μmol/L姜黃素5 min后ICa-L的電流曲線

2.2 姜黃素對大鼠心室肌細胞鈉、鈣通道電流密度-電壓曲線的影響

2.2.1 50μmol/L姜黃素對INa電流密度-電壓曲線的影響：如圖3所示，INa的激活電壓在-60 mV，峰電位在-30 mV，反轉(zhuǎn)電位在+20 mV。50μmol/L的姜黃素對所有指令電壓條件下均引起INa的降低，使電流密度-電壓曲線上移，不改變激活電位和反轉(zhuǎn)電位，峰值電位稍右移。

圖3 姜黃素（50μmol/L）對大鼠心室肌細胞INa的電流密度-電壓曲線的影響（±s，n=5）

2.2.2 50μmol/L姜黃素對ICa-L電流密度-電壓曲線的影響：如圖4所示，ICa-L從-30 mV開始激活，峰值電位在10 mV，反轉(zhuǎn)電位+35 mV。50μmol/L的姜黃素對ICa-L的電流密度-電壓曲線沒有明顯影響。

圖4 姜黃素（50μmol/L）對大鼠心室肌細胞ICa-L的電流密度-電壓曲線的影響（±s，n=5）

3 討論

多種跨膜離子流的復雜變化產(chǎn)生心室肌細胞的動作電位和靜息電位，即動作電位和靜息電位是多種離子通道綜合作用的結(jié)果，細胞膜離子通道電流的異常改變是形成各種心律失常的最重要因素。膜片鉗技術可直接測定膜離子通道電流的大小，是研究藥物對離子通道活性影響的最為直接的手段。

本研究以離子通道的角度初步觀察了姜黃素對大鼠心室肌細胞的影響。姜黃素直接調(diào)節(jié)各種離子通道活性的能力已毋庸置疑，有報道指出其對三磷酸肌醇受體鈣通道電流有抑制作用，而后又有研究表明姜黃素不可逆的抑制T型鈣通道電流[5-6]。然而對心室肌細胞而言，ICa-L的作用是至關重要的，ICa-L對動作電位平臺期的形成、細胞內(nèi)鈣增高以及心肌收縮起重要作用。本研究表明，50μmol/L的姜黃素的對大鼠心室肌細胞ICa-L沒有明顯影響，由于姜黃素在水中的溶解度非常低（小于0.01%）[7]，實驗過程中發(fā)現(xiàn)姜黃素在細胞外液中的最大溶解劑量是50～100μmol/L，更高濃度的姜黃素會與細胞外液產(chǎn)生明顯沉淀，所以沒有繼續(xù)研究更高濃度的姜黃素能否抑制ICa-L。

INa主要參與快反應細胞動作電位0期去極化，是影響心肌興奮性、不應性和傳導性的重要離子流[8]。根據(jù)本項目組對大鼠心臟離體灌流的實驗觀察發(fā)現(xiàn)，高濃度姜黃素（10～50μmol/L）能產(chǎn)生劑量依賴性的心臟功能抑制和致心律失常作用（另文報道）。本研究結(jié)果表明50μmol/L姜黃素對INa有明顯抑制作用，可以解釋姜黃素引起的離體灌流心臟心電圖的PR和QT間期延長、QRS電壓下降和時程延長等現(xiàn)象，同時也可以解釋由于0期去極化減慢，幅度降低導致的心肌功能抑制現(xiàn)象。本研究目前還只觀察了高濃度姜黃素對大鼠心室肌細胞的離子通道電流的影響，但低濃度姜黃素的作用目前還未知，有待進一步研究。

[1] Singh S. From exotic spice to modern drug?[J]. Cell,2007,130(5):765-768.

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[6] Enyeart JA, Liu H, Enyeart JJ.Curcumin Inhibits ACTH-and Angiotensin II-Stimulated Cortisol Secretion and Cav3.2 Current [J]. J Nat Prod, 2009,72(8):1533-1537.

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[8] 賈宏鈞, 王鐘林, 楊期東. 離子通道與心腦血管疾病-基礎與臨床[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2001: 24-71.