王守巖 高 原 關洪全 王 哲 馬賢德井 歡 王 瑩 趙金茹 柴繼嚴 王 健

遼寧中醫(yī)藥大學（遼寧沈陽 110847）

眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點腦組織TNF-α表達的影響*

王守巖 高 原 關洪全 王 哲 馬賢德井 歡 王 瑩 趙金茹 柴繼嚴 王 健△

遼寧中醫(yī)藥大學（遼寧沈陽 110847）

目的 通過觀察不同時限缺血再灌注損傷后腦組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達，探討TNF-α對腦缺血再灌注損傷的作用機制，并觀察眼針對其干預作用。方法SD大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組、眼針組；采用改良線栓法復制大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，選取眼穴肝區(qū)、腎區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)，平刺，進針3mm，留針20min；分別于腦缺血再灌注后3、24、72h處死動物并取材；應用免疫組織化學染色法和蛋白質印跡法（Western blot）檢測腦組織中TNF-α蛋白表達。結果 眼針組TNF-α在腦組織再灌注后3、24、72h均較模型組明顯降低，有顯著差異。結論 眼針療法可以降低腦缺血再灌注模型大鼠腦組織TNF-α的表達，進而抑制由腦缺血再灌注誘導的炎癥反應，發(fā)揮腦保護的作用。

眼針 缺血再灌注 腫瘤壞死因子-α

眼針療法是遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院彭靜山老先生發(fā)明的一種針刺療法，臨床應用多年，對缺血性腦中風等疾病具有很好的療效，國內外同行學者對其評價很高，但其機制尚未闡明。腦缺血再灌注后腦內腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達增加［1］，具有神經保護和促進神經修復等作用。但TNF-α在腦缺血再灌注中發(fā)生損傷的作用機制尚不完全清楚。本研究通過不同時限缺

血再灌注損傷后腦組織勻漿的TNF-α蛋白表達，探討TNF-α的損傷作用機制，并觀察眼針對其干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康SD大鼠96只，雌雄不拘，體質量（280±20）g，由北京維通利華實驗動物中心提供。適應性喂養(yǎng)1周，自由飲水、攝取標準顆粒飼料，室內溫度22℃，相對濕度45%。將大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、眼針組4組（根據缺血再灌注損傷時間分設3、24、72h亞組，共計3個觀察時間點），每亞組8只。

1.2 試劑 親和純化兔抗鼠TNF-α多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒及DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 模型制備與評價 模型組及眼針組采用改良的線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，模型制作按照文獻［2］記載方法進行。模型成功標準：大鼠于缺血2h后進行再灌注，再灌注后進行神經功能缺損評分，參照Longa 5分制評分標準［3］：0分為無癥狀；1分為不能完全伸展對側前爪；2分為向對側轉圈；3分為向對側傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達標準者排除。假手術組術式同模型、眼針組，區(qū)別在于釣魚線插入深度為0.5～1cm，其他同手術組。正常組未處理。

1.4 眼針取穴及刺法 眼針組：用31號13mm毫針，于大鼠眶周2mm處針刺，定位參照人體取穴方法［4］，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)針刺。手法：平刺，進針3mm。留針10min時用刮柄進行刮針1次，刮針5下。治療時間：3h眼針刺組于腦缺血再灌注即刻及其取材前30min，分別進行眼針治療；24h及72h眼針組于腦缺血再灌注即刻及其取材前30min分別進行眼針治療，此外，每12小時針刺1次。

圖1 大鼠眼針取穴示意圖

1.5 標本采集與檢測 （1）腦組織TNF-α蛋白表達（免疫組化SABC法）檢測：分別于缺血再灌注損傷3、24、72h給予大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，將灌注針頭從心尖部插入升主動脈，待右心耳膨起后剪開右心耳，依次迅速灌注0.9%生理鹽水200mL，4%多聚甲醛200mL，迅速取腦，在視交叉平面后約5～10mm處將腦冠狀切面切開，留取中間部分，置于4%多聚甲醛固定液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。將包埋的蠟塊作5μm切片，免疫組化按試劑盒操作。TNF-α以細胞漿或細胞核出現清晰棕褐色顆粒為陽性。使用BI2000醫(yī)學圖象分析系統對采集的圖像測定陽性反應物的灰度，每例動物隨機取3～4張切片，且各組所選部位相同。（2）腦組織TNF-α蛋白表達（Western blot法）檢測：分別于缺血再灌注損傷3、24、72h給予大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織，去掉小腦，沿兩側大腦半球連接處將大腦半球切開，取出病變側頂葉部分腦皮質，按腦組織凈重：裂解液=1：10的比例，加入相應體積的裂解液，pH為7.5，將樣品剪碎后勻漿、離心、上清即為總蛋白。兔抗鼠 TNF-α 一抗 （1∶500）；O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate顯色；掃描儀掃描NC膜，分析結果。

1.6 統計學處理 采用SPSS 10.0統計軟件分析，實驗數據均采用（±s）表示，采用方差分析進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 神經功能缺損程度評分 見表1。模型組和眼針組大鼠均出現不同程度的神經功能障礙，如提尾時左側前肢不能伸直，行走向對側旋轉或傾倒等；假手術組大鼠無神經功能障礙表現。與模型組比較，眼針組再灌注損傷3、24、72h后神經功能缺損程度評分均有差異（P＜0.01）。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點神經缺損程度評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點神經缺損程度評分比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

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2.2 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點腦組織TNF-α蛋白表達的影響

2.2.1 免疫組化方法檢測結果 見圖2、表2。模型組腦組織TNF-α表達明顯強于正常組和假手術組。正常組和假手術組大鼠各時點僅有少量TNF-α陽性染色，模型組TNF-α的陽性表達在3h開始升高，24h較為明顯，72h達高峰。與模型組比較，眼針組TNF-α的陽性表達在3h開始減少，24h表達明顯減少，72h表達減少最為顯著。眼針組TNF-α表達明顯低于模型組，均有顯著差異（P＜0.01）。

圖2 各組腦皮層TNF-α蛋白表達切片圖（SABC 法，×400，箭頭示 TNF-α 蛋白表達）

表2 各組大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點腦組織TNF-α蛋白表達比較（灰度值，±s）

表2 各組大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點腦組織TNF-α蛋白表達比較（灰度值，±s）

與正常組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n 3h 24h 72h正常組 8 114.86±10.50 114.86±10.50 114.86±10.50假手術組 8 119.71±8.92 121.10±8.92 122.08±8.92模型組 8 153.42±12.17△ 158.46±13.49△ 161.85±13.21△眼針組 8 137.73±12.08** 138.76±12.08** 138.96±12.08**

2.2.2 Western blot方法檢測結果 見圖3、表3。以β-actin為內參，表達結果為：1泳道為正常對照組，2泳道為假手術3h組，3泳道為模型3h組，4泳道為眼針3h組，5泳道為假手術24h組，6泳道為模型24h組，7泳道為眼針24h組，8泳道為假手術72h組，9泳道為模型72h組，10泳道為眼針72h組。模型組TNF-α蛋白表達強度明顯強于對照組和假手術組，眼針組表達明顯低于模型組，均有顯著差異（P＜0.05）。

圖3 大腦皮層TNF-α蛋白表達電泳圖

表3 各組大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點腦組織TNF-α蛋白表達比較（灰度值，±s）

表3 各組大鼠腦缺血再灌注損傷不同時間點腦組織TNF-α蛋白表達比較（灰度值，±s）

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3 討 論

TNF是一類能直接導致某些腫瘤細胞壞死的細胞因子，人體內的TNF主要是TNF-α。TNF-α在腦缺血性疾病中具有雙重性，適當的TNF-α可調節(jié)機體的免疫功能，增強對入侵病原體的抵抗力，對維持機體內穩(wěn)態(tài)及抵制各種致病因子具有重要意義。而過量的TNF-α則可導致多種病理改變。國外研究證明，炎性細胞因子TNF-α僅作為缺血性腦損傷所誘發(fā)的初始調節(jié)因子，其表達上調與腦缺血再灌注損傷密切相關，參與了腦缺血再灌注損傷病理過程［5］。

本實驗結果顯示，正常組和假手術組大鼠腦組織僅見少量TNF-α表達，說明TNF-α在正常腦組織中低含量存在，可能與神經細胞的正常維護有關。模型組大鼠腦組織TNF-α蛋白表達在缺血再灌注3h開始升高，隨著缺血再灌注時間的延長，24h明顯升高，72h升高達高峰，說明腦缺血再灌注后72h內，TNF-α的表達隨時間的延長而逐漸增多，其原因可能與腦缺血缺氧等刺激，以及膠質細胞壞死溢出有關。給予眼針治療后，大鼠腦組織TNF-α蛋白在各時相均明顯下降，說明眼針在腦組織缺血再灌注中能夠抑制TNF-α的表達，減輕對腦組織的損傷。

眼針是在眼眶周圍針刺以治療全身疾病的一種微針技術，它是針灸施術的一種特殊針法。腦為奇恒之府，腦由髓匯集而成，故名“髓?！保X是精髓和神明高度匯集之處，有元神之府。眼與腦密切相連。《證治準繩》載“目形類丸，內有大絡六，謂心、肺、脾、肝、腎，命門各主其一；中絡八，謂膽、胃、大小腸，三焦、膀胱各主其一；外有旁支細絡莫知其數，皆懸貫于腦”［6］。說明眼通過經絡與腦密切相連。“五臟六腑之精氣，皆上注于目，而為之晴。精之窠為眼，其窠氣之精為白眼，肌肉之精為約束。裹擷筋骨血氣之精，而與脈并為系，上屬于腦，后出于項中，故邪入于項，因逢其身之虛，其入深，則隨目系以入腦。”［7］“八廓應乎八卦，脈絡經緯于腦，貫通臟腑，以達血氣，往來以滋于目?！闭f明眼與腦通過經絡密切相連，生理上相互協調，病理上也是病邪傳變的途徑。腦缺血再灌注損傷屬中醫(yī)“中風”范疇，是由臟腑功能失調，氣血逆亂，腦脈閉阻而成，屬本虛標實之證。本實驗取眼針肝區(qū)、腎區(qū)補益肝腎以充髓海，治其本，上焦區(qū)、下焦區(qū)活血化瘀以通經絡，開竅醒神以治其標。本研究表明眼針通過直接抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織TNF-α蛋白的表達來實現對腦細胞損傷的保護可能是其作用機制之一。

［1］Wang Y，Kawamura N，Schmelzer JD，et al.Decreased peripheral nerve damage after ischemia-reperfusion injury in mice lacking TNF-α ［J］.Neurol Sci， 2008，267（1–2）：107-111.

［2］馬賢德，孫宏偉，等.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2009，27（6）：1200-1201.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［4］彭靜山.眼針療法［M］.沈陽：遼寧科學技術出版社，1990：11.

［5］Sairanen T，Carpen D，Karjalainen-lindsberg ML，et al.Evolution of cerebral tumor necrosis factor-a production during human ischemic stroke［J］.Stroke，2001，32（8）：1750-1758.

［6］明·王肯堂.證治準繩［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，1997：226.

［7］程士德.內經講義·靈樞·大惑論［M］.上海：上?？萍汲霭嫔?，1984：56.

Effect of Eye Acupuncture Therapy on Brain TNF-α Expression at Different Time Points in Rats with Cerebral Ischemia Reperfusion

WANG Shou-yan,GAO Yuan,GUAN Hong-quan,et al
Liaoning University of Traditional Chinese Medcine（Shenyang 110847,Liaoning）

Objective:To investigate TNF-α expression at different time points in the brain of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury,in order to discuss the mechanism and observe the intervention effects of eyeacupuncture therapy.Methods:Healthy SD rats,male and female,were randomly divided into 4 groups:the normal group,the sham-operated control group,the model group and the eye-acupuncture group.The sham-operated control group,the model group and the eye-acupuncture group were divided into the 3h group,the 24h group and the 72h group.The rat model of cerebral ischemia-reperfusion was established by suture method.Eye acupoint liver area,kidney area,upper jiao area and lower jiao area were selected and acupunctured horizontally,inserting needle in 3mm deep,retaining needle for 20 minutes.All animals were executed respectively at 3h,24h,72h after reperfusion and draw materials.The method of immunohistochemistry and Western blot technology was taken to detect the changes of brain TNF-α expression in rats after the eye-acupuncture therapy.Results:Compared with the model group,TNF-α expressions in the brain of rats of the eye-acupuncture group were decreased obviously at 3h,24h,72h after reperfusion.These differences were significant.Conclusion:The eye-acupuncture therapy can regulate down brain TNF-α expressions in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury,suppress inflammatory response induced by cerebral ischemia-reperfusion and play a role in protecting brain.

Eye acupuncture;Ischemia-reperfusion;Tumor necrosis factor-α

R245.3

A

1004-745X（2011）12-1939-03

國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目（2007CB512702）

△通信作者

2011-07-24）